Der Verlust der Mst1/2-Aktivität fördert die Nichtaktivität

Jul 07, 2023

npj Regenerative Medicine Band 7, Artikelnummer: 64 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die sensorischen Haarzellen (HCs) von Säugetieren haben eine begrenzte Regenerationsfähigkeit, was nach dem Tod des HC zu einem dauerhaften Hörverlust führt. Hier verwendeten wir In-vitro-RNA-Sequenzierung, um zu zeigen, dass der Hippo-Signalweg an HC-Schäden und Selbstreparaturprozessen beteiligt ist. Das Ausschalten der Hippo-Signalisierung durch Mst1/2-Hemmung oder Yap-Überexpression induziert eine YAP-Kernakkumulation, insbesondere in Stützzellen, was zu einer überzähligen HC-Produktion und HC-Regeneration nach einer Verletzung führt. Mechanistisch gesehen wirken diese Effekte der Hippo-Signalübertragung synergetisch mit dem Notch-Signalweg. Wichtig ist, dass die überzähligen HCs nicht nur HC-Marker exprimieren, sondern auch über Zilienstrukturen verfügen, die in vivo neuronale Verbindungen zu Hörregionen herstellen können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Regulierung von Hippo neue Strategien zur Förderung der Zellproliferation, der HC-Regeneration und der Wiederverbindung mit Neuronen bei Säugetieren fördert.

Eine Schädigung der Haarzellen (HC) führt zu einem dauerhaften sensorineuralen Hörverlust und betrifft Millionen von Menschen auf der ganzen Welt1,2. Geschädigten erwachsenen HCs von Säugetieren fehlt die Regenerationsfähigkeit3,4, obwohl Stützzellen (SCs) eine potenzielle Ressource für die Regeneration von HCs5,6 darstellen. Wenn HCs in der Cochlea eines neugeborenen Säugetiers beschädigt werden, können SCs HCs entweder durch mitotische Regeneration oder durch direkte Transdifferenzierung nach Aktivierung von Stammzellen oder Vorläuferzellen regenerieren, diese Regenerationsfähigkeit ist jedoch recht begrenzt7,8,9,10,11. Wichtig ist, dass keine HC-Regeneration stattfindet, wenn die Ablation von HCs nach einem Alter von einer Woche in vivo induziert wird12,13. Die Wechselwirkungen und Mechanismen, die der Regeneration zugrunde liegen, erfordern weitere Forschung, insbesondere im Zusammenhang mit zellulären Schädigungsparadigmen.

Hippo-Signalisierung ist ein hochkonservierter Signalweg, der eine pleiotrope Rolle bei der Modulation der Zellproliferation, -differenzierung, -überleben und -tod spielt14. Bei Säugetieren besteht der Hippo-Signalweg aus den Serin/Threonin-Kinasen „säugetiersterile 20-ähnliche Kinase 1/2“ (MST1/2) und „großer Tumorsuppressor 1/2“ (LATS1/2), während das „Yes-assoziierte Protein“ (YAP) das ist Haupt-Downstream-Mediator des Hippo-Signalwegs15,16,17. Bei Stimulation aktiviert phosphoryliertes MST1/2-SAV1 den LATS1/2-MOB1a/b-Komplex, der wiederum den nachgeschalteten Transkriptionseffektor YAP phosphoryliert, um dessen zytoplasmatische Lokalisierung, die Hippo-on18 genannt wird, zu fördern. Ohne Phosphorylierung wird YAP in den Zellkern umgeleitet (Hippo-off), wo es mit dem Transkriptionskofaktor Tead zusammenarbeitet, um seine Zielgene zu regulieren, die an der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind19,20.

Frühere Studien konzentrierten sich auf die wichtige Rolle des Hippo-Signals bei der Tumorentstehung, da die Hochregulierung des Hippo-Signals das Zellwachstum fördert und die Zellapoptose in fast allen Tumorgeweben hemmt21, insbesondere deren Wechselwirkung mit anderen Signalwegen22,23. Eine vergleichende Microarray-Analyse zeigte, dass Yap-Mangel Veränderungen der Genexpression im Wnt-Signalweg hervorruft, und dies könnte mit der HC-Regeneration (Neuromast) bei Zebrafischen verbunden sein24. Im auditorischen System haben Gnedeva et al. berichteten, dass der bedingte Verlust von Yap mit dem Austritt des Zellzyklus im Corti-Organ im Embryonalstadium verbunden war und zu deutlich kleineren Sinnesorganen führte25. Die Erkenntnisse von Rudolf et al. schlugen vor, dass Zellschäden die inhibitorische Hippo-Signalübertragung überwinden und die regenerative Proliferation in Nicht-Säugetier-Utrikeln erleichtern, wohingegen die Unterdrückung der YAP-TEAD-Signalübertragung in Säugetier-Utrikeln zur Aufrechterhaltung der proliferativen Ruhe beiträgt26. Die unterschiedlichen zellulären Lokalisationen von YAP können teilweise für die Regenerationsfähigkeit der Utrikel bei Küken verantwortlich sein27. Die meisten Studien zum Hippo-Signalweg konzentrierten sich jedoch auf seine Funktion bei der Hemmung der Zellproliferation und der Förderung des Rückzugs aus dem Zellzyklus im Innenohr und nicht auf seine Anwendung zur Förderung der HC-Regeneration.

In dieser Studie haben wir uns auf die Hippo-Signalübertragung in der Cochlea von Mäusen konzentriert und herausgefunden, dass sie an den Prozessen der HC-Regeneration beteiligt ist. Wir fanden außerdem heraus, dass die nukleare Akkumulation von YAP nach einer Neomycin-Insultation zunimmt und dass die Förderung des Eindringens von YAP in den Zellkern bei neugeborenen Mäusen zu einer erhöhten Bildung von überzähligem HC führt. Noch wichtiger ist, dass unsere Ergebnisse zeigten, dass die neu erzeugten HCs, die nach Mst1/2-Knockout in Sox9-positiven Stützzellen (SCs) induziert wurden, in vivo funktionsfähig waren, was bei Säugetieren besonders bemerkenswert ist.

Aminoglykosid-Antibiotika (wie Neomycin) sind bekannte Toxine für cochleäre HCs, und nach der Neomycin-Behandlung wurde in Cochleae ein fortschreitender HC-Verlust von der apikalen zur basalen Windung festgestellt (Abb. 1a–c, Abb. S1). Mittlerweile wurden in solchen Situationen nur sehr wenige proliferative SCs beobachtet, und diese waren größtenteils in den apikalen Windungen verteilt (Abb. 1d). Um den molekularen Mechanismus basierend auf der SC-Proliferation zu untersuchen, wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) normalisierter RNA-seq-Daten durchgeführt, um die Gesamtvarianzen zwischen und innerhalb der beiden Gruppen zu untersuchen. Mit Neomycin behandelte Zellen und Kontrollzellen bildeten unterschiedliche Cluster entlang PC1, was 86 % der Varianz erklärte. Die Varianz innerhalb der Gruppe wurde durch PC2 aufgedeckt, die nur 7 % der Varianz ausmachte. Aus dem Vulkandiagramm und der Analyse der Genontologie haben wir herausgefunden, dass der Ribonukleoproteinkomplex und die Ribosomenbiogenese deutlich hochreguliert waren, was eng mit der Zellproliferation oder -regeneration zusammenhängt (Abb. S2). Die Signalweganalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes zeigte, dass eine große Anzahl von Signalwegen, darunter Hippo und Notch, am Prozess des HC-Todes oder der SC-Proliferation beteiligt waren (Abb. 1e). Wir konzentrierten uns auf Veränderungen in der Hippo-Signalübertragung nach einer HC-Schädigung und stellten fest, dass 56 Gene im Hippo-Signalweg und seinen nachgeschalteten Genen mit HC-Schäden und Reparaturprozessen assoziiert waren, darunter Mst1, Lats1/2, Mob1b und Amotl2 (Abb. 1f). .

a Cochleae neugeborener P2-Mäuse wurden isoliert und 12 Stunden lang kultiviert, dann 6 Stunden lang mit 1 mM Neomycin geschädigt und weitere 5 Tage mit 10 μM EdU kultiviert. b, c Nach der Neomycin-Schädigung nahm der HC-Tod von der Spitze zur Basis der Cochlea zu (Myosin7a+ HCs, Spitze: 109,0 ± 6,4; Mitte: 76,7 ± 6,7; Basis: 43,0 ± 4,6), und zweifache ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrere Vergleichstests zeigten, dass es einen signifikanten Unterschied in den mittleren und basalen Windungen gab. d Nach einer HC-Schädigung wurden nur sehr wenige proliferative SCs beobachtet (Sox2/EdU-doppelt positive SCs, Spitze: 2,4 ± 0,6; Mitte: 1,4 ± 0,5; Basis: 0,6 ± 0,4), obwohl eine Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest dies zeigte der signifikante Unterschied in der apikalen und mittleren Windung. e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Signalweganalyse der Transkriptomdaten. f Heatmap, die die relativen Expressionsniveaus der unterschiedlich exprimierten Gene zeigt, die mit dem Hippo-Signalweg nach einer HC-Schädigung assoziiert sind. (FDR < 0,01; n = 3 für jede Bedingung). Stärker exprimierte Gene werden in Rot dargestellt, während Gene mit relativ geringeren Konzentrationen in Blau dargestellt werden. g–i Cochleae von P2-Mäusen wurden präpariert und 12 Stunden lang kultiviert und dann 6 Stunden lang mit 1 mM Neomycin behandelt. Nach einer weiteren 24-stündigen Kultur wurde eine immunhistochemische Färbung durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollgruppen zeigten die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung und der relativen quantitativen Fluoreszenzanalyse, die mit zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests analysiert wurden, dass die nukleare Akkumulation von YAP (rot) in Sox2+-SCs (weiß) nach einer Neomycin-Verletzung erhöht war. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm.

Wir beobachteten außerdem, dass die nukleare Akkumulation von YAP in SCs durch eine Neomycin-Beleidigung ausgelöst werden könnte (Abb. 1g – i). Es wurde berichtet, dass die YAP-Kernakkumulation im Corti-Organ vom Embryo bis zum Neugeborenen schnell abnimmt, wie unsere Ergebnisse bestätigen (Abb. S3), was darauf hindeutet, dass die YAP-Translokation vom Zytoplasma zum Zellkern mit der Regenerationsfähigkeit der Cochlea zusammenhängt Zellen.

XMU-MP-1, ein selektiver MST1/2-Inhibitor28, wurde verwendet, um die Hippo-Signalübertragung in der Cochlea der Maus pharmakologisch auszuschalten (Abb. 2a). YAP war im SC-Kern erhöht (Abb. 2b – h) und die Expression von Hippo-bezogenen Downstream-Genen war dosisabhängig erhöht (Abb. 2i). Nach der Inkubation mit XMU-MP-1 war der Anteil an nuklearem YAP erhöht und der Anteil an phosphoryliertem YAP im Corti-Organ verringert, während der Anteil an phosphoryliertem LATS-1 abnahm (Abb. 2j, k, S4).

a Cochleae von neugeborenen P2-Mäusen wurden isoliert und kultiviert. Nach 12 Stunden wurde 24 Stunden lang 1 μM oder 5 μM XMU-MP-1 zugegeben. b–g Die Verteilung von YAP (rot) in Sox2+ SCs (weiß) aus P2-Neugeborenenkontrolle und mit 1 µM bzw. 5 µM XMU-MP-1 behandelten Maus-Cochleaen. Die gelben Pfeile zeigen an, dass die YAP-Kernakkumulation in der Kontrollgruppe sehr gering war, während die weißen Pfeile darauf hinweisen, dass die YAP-Kernakkumulation in den XMU-MP-1-Gruppen erhöht war. h Die relative Fluoreszenz von YAP in den Kernen und im Zytoplasma von SCs in der Kontrollgruppe und der mit XMU-MP-1 behandelten Gruppe wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Mehrfachvergleichstest von Dunnett analysiert, was darauf hinweist, dass XMU-MP-1 die Translokation signifikant förderte von YAP in den Kern. i Die relativen mRNA-Expressionsniveaus von Hippo-Signalweg-bezogenen Genen und Downstream-Genen nach exogener XMU-MP-1-Behandlung, analysiert mit einer Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. j, k Die Western Blots und die relative Fluoreszenzquantifizierung von p-YAP, p-LATS, YAP und LATS in der Kontrollgruppe und den XMU-MP-1-Gruppen wurden mit Zwei-Wege-ANOVA und anschließendem Dunnett-Mehrfachvergleichstest analysiert. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm.

Als nächstes haben wir Mst1fl/fl/Mst2fl/fl generiert; Transgene Sox9-CreERT2/+-Mäuse schalten Hippo spezifisch in SCs in vivo aus (Abb. 3a), was bestätigte, dass der bedingte Knockout von Mst1/2 in SCs die YAP-Translokation in die SC-Kerne vorantreibt (Abb. 3b, c). Das schematische Diagramm in Abb. 3d zeigt die Strukturen und Zellsubtypen der Cochlea. Wir bestätigten, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen transgenen Mst1fl/fl/Mst2fl/fl-Mäusen und Wildtyp-Mäusen (WT) ohne Cre-Aktivierung gab (Abb. S5). Bei der Tamoxifen-Injektion in den WT-Kontrollgruppen wurden am postnatalen Tag (P)7 keine EdU+/Sox2+-Zellen beobachtet, was darauf hinweist, dass postnatale SCs nach der Geburt mitotisch im Ruhezustand waren (Abb. 3e). Allerdings führte die Tamoxifen-Injektion zu einer signifikanten Anzahl von Sox2+/EdU+-Zellen bei den Mst1/2-Knockout-Mäusen sowohl im sensorischen Bereich (SR) als auch im größeren Epithelkamm (GER) (Abb. 3e – h). Insbesondere wurden mehrere mit Hippo-Signalen in Zusammenhang stehende Gene sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene verändert (Abb. S6, S7).

a Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+-Mäuse wurden verwendet, um Mst1/2 in Sox9+-SCs auszuschalten und so die Hippo-Signalisierung auszuschalten, um die YAP-Kerntranslokation zu fördern. Tamoxifen wurde bei P1–2 injiziert, EdU wurde bei P2–7 injiziert und die Cochleae wurden bei P7 geerntet. b Im Vergleich zu den Kontrollgruppen gab es bei Mst1f1/f1/Mst2fl/fl viel mehr YAP-Kerntranslokation; Sox9-CreERT2/+ Mäuse. Die Kerne sind weiß eingekreist. Im Vergleich zu den Kontrollen wurde in der Mst1/2-Knockout-Gruppe mehr YAP in den Zellkern transferiert. c Die relative Fluoreszenz von YAP in den Kernen und im Zytoplasma von SCs in Kontroll- und Mst1/2-Knockout-Mäusen wurde mit zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests analysiert, was darauf hinweist, dass Mst1/2-Knockout die Translokation von YAP in den Kern förderte. d Das schematische Diagramm der Schnittansichten des Corti-Organs. DC, Deiters-Zelle; PC, Säulenzelle; IPhC, innere Phalangealzelle; IBC, innere Grenzzelle; GER, größerer Epithelkamm. e–h In Kontrollmäusen wurden nur sehr wenige EdU+-SCs nachgewiesen, und eine Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest zeigte, dass es im SR und GER eine signifikant größere Anzahl von Sox2+/EdU+-SCs gab, wobei die Gesamtmenge an Sox2+-SCs abnahm Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+ Mäuse. i–m Es gab eine große Anzahl neu erzeugter HCs sowohl bei den IHCs als auch bei den OHCs, und viele Sox2+/Myosin7a+-HCs wurden sowohl bei den IHCs als auch bei den OHCs von Mst1f1/f1/Mst2fl/fl nachgewiesen; Sox9-CreERT2/+-Mäuse (i) und eine Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest, wurden durchgeführt, um die signifikanten Unterschiede aufzuzeigen. n Sehr wenige Myosin7a+/EdU+-HCs, etwa 0–2 pro Cochlea, wurden in Mst1f1/f1/Mst2fl/fl beobachtet; Sox9-CreERT2/+ Mäuse. o Das schematische Diagramm der SC-Proliferation in Mst1/2-Knockout-Mäusen in vivo. p Das schematische Diagramm überzähliger HCs in Mst1/2-Knockout-Mäusen in vivo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm.

Myosin7a wurde als Marker für HCs verwendet, während Sox2 als SC-Marker29,30 verwendet wurde. In der HC-Schicht der P7-Mäuse gab es bei den transgenen Mäusen eine große Anzahl von Myosin7a+/Sox2+-Zellen, bei den Kontroll-Wurfgeschwistern wurden jedoch keine beobachtet. Die Gesamtzahl sowohl der inneren HCs (IHCs) als auch der äußeren HCs (OHCs) war signifikant größer, während die Gesamtzahl der Sox2+-Zellen in der SC-Schicht bei den transgenen Mäusen kleiner war als bei den Kontrollen (Abb. 3i, j, k). Interessanter ist, dass es in den transgenen Mäusen eine signifikant größere Anzahl von Myosin7a+/Sox2+-Zellen gab, mit einem abnehmenden Trend von der Spitze zur Basis in der Cochlea (Abb. 3l, m). Es wurde berichtet, dass einige Zellen, die Myosin7a+ sind, auch Sox2+-Kerne haben, was darauf hindeutet, dass es sich um neu erzeugte HCs aus Sox2+-Zellen handelt, die sich jedoch noch in einem unreifen Stadium befinden30,31. Somit führte die direkte Differenzierung von SCs in HCs über die YAP-Kerntranslokation zu einer erhöhten Anzahl von HCs und einer verringerten Anzahl von SCs (Abb. 3f, j, k). Darüber hinaus wurden in den transgenen Mäusen seltene Myosin7a+/EdU+-Zellen gefunden, was auf das Vorhandensein einer mitotischen HC-Erzeugung hinwies (Abb. 3n). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei Mst1/2-Mäusen mit bedingtem Knockout sowohl die direkte Differenzierung als auch die mitotische Erzeugung von HCs aus SCs über YAP-Kerntranslokation gleichzeitig auftraten, die direkte Differenzierung war jedoch der dominierende Mechanismus (Abb. 3o, p).

Sox9 ist ein Mitglied der Sox-Familie der Transkriptionsregulatoren. Es wird hauptsächlich in SCs im Entwicklungsstadium des Innenohrs ausgedrückt32. Um den Ursprung der proliferierenden SCs und überzähligen HCs zu identifizieren, die durch die nukleare YAP-Translokation induziert werden, wurden die Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Rosa26-tdTomato/+-Mauslinien wurden erstellt, um Mst1 und Mst2 in den Sox9-tdTomato+-SCs bedingt auszuschalten. Die Ergebnisse legen nahe, dass sowohl die proliferativen SCs als auch die differenzierten HCs von Sox9+-SCs stammten. Darüber hinaus stammten die seltenen Myosin7a+/EdU+-Zellen auch von Sox9-tdTomato+-Zellen und entsprachen mitotisch erzeugten HCs in den linienbasierten Sox9+-SCs (Abb. S8). Zusammenfassend handelte es sich bei den meisten überzähligen HCs um Sox9-tdTomato+/EdU–, was wiederum zeigt, dass die direkte Differenzierung die HC-Erzeugung bei der Hemmung der Hippo-Signalisierung dominierte und dass diese neuen HCs von Sox9-tdTomato+-SCs abstammten.

Um die Subtypen der neu generierten HCs im Mst1fl/fl/Mst2fl/fl zu identifizieren; Sox9-CreERT2/+-Mäuse, vGlut3, Prestin und Oncomodulin (OCM) wurden zur Markierung der neuen überzähligen HCs verwendet. Die Myosin7a+-Zellen in der OHC-Region exprimierten Prestin, während diejenigen in der IHC-Region vGlut3 exprimierten (Abb. 4a – f). Eine frühere Studie zeigte, dass die OCM-Markierung hauptsächlich auf OHCs beschränkt war, mit einer gewissen Immunreaktivitätsmarkierung bei IHCs in den frühen Entwicklungsstadien33. Bemerkenswerterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass fast alle neuen HCs in den transgenen Mäusen OCM+ waren, während OCM-Immunreaktivität fast ausschließlich in den OHCs in der Kontrollgruppe mit sehr geringer Expression in den IHC-Reihen bei P7 beobachtet wurde. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass sich die neu erzeugten HCs in gewissem Maße von den ursprünglichen HCs unterschieden und möglicherweise unreifer waren.

a–f Die überzähligen ektopischen HCs in Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+-Mäuse wurden mit dem IHC-Marker vGlut3 und dem OHC-Marker Prestin gefärbt. Im Vergleich zu WT-Mäusen wurden die neu erzeugten HCs mit OCM markiert, obwohl sie sich in der IHC- und OHC-Region befanden. g Phalloidin wurde zur Markierung der Stereozilienstruktur und Tuj1 zur Markierung der Nervenfaser verwendet. Bei P7-Kontrollmäusen wurde eine „V“-förmige Struktur in OHCs und eine „–“-förmige Struktur in IHCs beobachtet, die mit Phalloidin markiert waren und von geordneten Nervenfaserverbindungen umgeben waren, die mit Tuj1 markiert waren. h In P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+-Mäuse, fast alle HCs – einschließlich regenerierter HCs – hatten ähnlich geformte „V“- und „–“-Strukturen, die in den OHCs bzw. IHCs mit Phalloidin markiert waren. Die Tuj1-Markierung zeigte 1–2 Reihen innerer HCs und 3–5 Reihen äußerer HCs, umgeben von unregelmäßigen Nervenfasern. i, j Die Schnittansichten der Phalloidin- und Tuj1-Färbung bei Kontrollmäusen und transgenen Mäusen bei P7. k–m Die repräsentative Ansicht der Ziliarstrukturen von der apikalen zur basalen Windung des Corti-Organs bei WT-Mäusen unter einem Elektronenmikroskop. n–p Im Wurfgeschwister P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Bei Sox9-CreERT2/+-Mäusen wurden unreife Haarbündel mit einer Abnahme von der apikalen zur basalen Windung festgestellt. Rechts sind die vergrößerten Ansichten der IHC- und OHC-Bündel in situ bei Kontroll- und Mst1/2-Knockout-Mäusen sowie die unreifen ektopischen Haarbündel mit etwas längeren Mikrovilli und einem Kinocilium von der apikalen zur basalen Windung dargestellt. q Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Zur Durchführung des Patch-Clamp-Experiments wurden Rosa26-tdTomato/+-Mäuse verwendet. Nach der Tamoxifen-Injektion bei P1-2 wurden die Cochleae bei P7 geerntet, sodass die Sox9-tdTomato+ HCs unter einem Mikroskop beobachtet werden konnten. r Repräsentative nach außen gerichtete K+-Ströme von WT P7 OHCs, hervorgerufen durch die oben gezeigten Spannungsschritte. s Repräsentative nach außen gerichtete K+-Ströme regenerierter HCs in transgenen Mäusen, hervorgerufen durch die gleichen oben gezeigten Spannungsschritte. t Mittelwert ± SEM IK (verzögerter Gleichrichter-Kaliumstrom) als Reaktion auf 0 mV-Depolarisation von WT P7 OHCs (n = 10) und regenerierten HCs (n = 19). u Mittelwert ± SEM-Spitzenstrom-Spannungs-Beziehungen von WT P7 OHCs und regenerierten HCs. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm in (a–f, g, h). Maßstabsbalken = 5 μm bei niedriger Vergrößerung bzw. 2 μm bei hoher Vergrößerung in (k–p).

Tuj1 wurde verwendet, um die auditorischen neuronalen Projektionen zu markieren, die in vivo von regenerierten HC-ähnlichen Zellen umgeben sind. Bei den Kontrollmäusen waren eine Reihe IHCs und drei Reihen OHCs von Nervenfaserverbindungen umgeben. Im Gegensatz dazu gab es bei den transgenen Mäusen 1 oder 2 Reihen IHCs und 3–5 Reihen OHCs, und die Neuriten um jeden HC wuchsen zum SR hinaus, wie sowohl im koronalen als auch im axialen Schnitt zu sehen war (Abb. 4g – j). Die Stereozilien der Cochlea-HCs waren in beiden Gruppen als erkennbare „V“-förmige Struktur bei OHCs und als „–“-förmige Struktur bei IHCs angeordnet, während die Zilien der regenerierten HCs in den transgenen Gruppen leicht unorganisiert und nicht ausgerichtet waren Mäuse. Rasterelektronenmikroskopie wurde verwendet, um die Zilien neu regenerierter HCs weiter sichtbar zu machen, und wir fanden unreife Haarbündel in den neuen HCs bei P7 (Abb. 4k – p). Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf den Status neu erzeugter HCs in vivo, die im Vergleich zu WT-Mäusen ähnliche, aber unreife Ziliarstrukturen aufweisen. Darüber hinaus wurde die grüne Fluoreszenz des FM1-43FX-Farbstoffs mit tdTomato nach dem Knockout von MST1/2 in Sox9+-SCs gemeinsam markiert, was darauf hinwies, dass die neuen HCs über funktionelle Transduktionskanäle verfügten (Abb. S8i).

In diesen überzähligen HCs wurde ein Ganzzell-Patch-Clamp-Experiment durchgeführt. In den neu erzeugten HCs wurden anhaltende K+-Ströme nach außen aufgezeichnet, ähnlich wie bei HCs im Verlauf der Entwicklung im Corti-Organ. Diese Ergebnisse zeigten, dass regenerierte HCs in vivo über einige Transduktionskanäle und elektrophysiologische Funktionalität verfügen (Abb. 4q – u).

Die Wirkung von XMU-MP-1 in Neomycin-geschädigten Cochleae in vitro ist in Abb. 5a dargestellt. Wir fanden heraus, dass mit der XMU-MP-1-Behandlung viel mehr Myosin7a+/Sox9-tdTomato+-Zellen im Vergleich zu den Kontroll-Cochleae erzeugt wurden (Abb. 5b, c). Zahlenmäßig wurden in der mit XMU-MP-1 behandelten Gruppe mehr Sox9-tdTomato+/Myosin7a+-Zellen gefunden, mit einem abnehmenden Muster von der Spitze zur Basis (Abb. 5d), was darauf hinweist, dass sich eine große Anzahl von Sox9+-SCs direkt differenziert hatte HCs als Reaktion auf XMU-MP-1.

ein Sox9-CreERT2/+; Rosa26R-tdTomato/+ und Atoh1-CreEsr1/+; Rosa26R-tdTomato/+-Mausmodelle wurden verwendet, um die SC- und HC-Linien zu verfolgen. Tamoxifen wurde bei P1 injiziert, um die tdTomato-Expression über Nacht zu aktivieren, und die Cochleae wurden bei P2 geerntet und dann in vitro kultiviert. Nach 6-stündiger Neomycin-Exposition wurden die Cochlea-Explantate 5 Tage lang mit exogenem XMU-MP-1 oder 0,5 % DMSO kultiviert. b–d Im Vergleich zu den Kontrollen war die Anzahl der Myosin7a+/Sox9-tdTomato+-HCs von der apikalen zur basalen Wende in der mit XMU-MP-1 behandelten Gruppe, analysiert mit Zwei-Wege-ANOVA und anschließendem Sidak-Mehrfachvergleichstest, stark erhöht. e–g Es gab eine große Anzahl von Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– HCs in den mit XMU-MP-1 behandelten Gruppen im Vergleich zu Kontrollen, die mit Zwei-Wege-ANOVA und anschließendem Sidak-Mehrfachvergleichstest analysiert wurden. h Das schematische Diagramm von Myosin7a+/Sox9-tdTomato+ HCs nach XMU-MP-1-Behandlung. i Das schematische Diagramm von Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– HCs nach XMU-MP-1-Behandlung. j, k Die Cochlea-Explantate von P2 WT-Mäusen wurden geerntet und dann kultiviert. Nach 6-stündiger Neomycin-Exposition wurden die Explantate 24 Stunden lang mit exogenem XMU-MP-1 oder 0,5 % DMSO kultiviert. Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung zeigten, dass die Zugabe von XMU-MP-1 die nukleare Akkumulation von YAP1 in Sox2+-SCs nach einer Neomycin-Verletzung signifikant erhöhte. l, m Nach der Neomycin-Verletzung wurden die Cochleae für weitere 5 Tage mit DMSO oder XMU-MP-1 kultiviert und die ganze Zeit über 10 μM EdU zugegeben, um proliferierende Zellen zu verfolgen. In der Kontrollgruppe mit DMSO-Behandlung wurden keine proliferierenden HCs und nur sehr wenige SCs nachgewiesen. In der mit XMU-MP-1 behandelten Gruppe gab es einige EdU+ SCs und HCs von der apikalen bis zur basalen Wende. n Die EdU+-HCs waren größtenteils im Tunnel zwischen den inneren und äußeren HCs verteilt und erschienen meist paarweise und mit Sox2 gefärbt. o–q Im Vergleich zu den Kontrollgruppen gab es einen signifikanten Anstieg der Anzahl proliferierender SCs und HCs nach Zugabe von XMU-MP-1 in vitro, analysiert mit Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Gesamtzahl der HCs wurde deutlich erhöht. r–t Nur etwa 16 % der HCs waren EdU+ im Vergleich zum erhöhten Anteil an HCs in der apikalen Kurve; sHC: überzähliger HC. u Das schematische Diagramm der mitotisch regenerierten HCs und proliferierenden SCs. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm.

Atoh1, ein Mitglied der bHLH-Transkriptionsfamilie, ist für die frühe HC-Entwicklung im Innenohr notwendig und ausreichend. In Atoh1-CreEsr1/+; Bei Rosa26R-tdTomato/+-Mäusen stellten wir fest, dass in der Kontrollgruppe die meisten HCs Atoh1-tdTomato+ waren, während sich bei den transgenen Mäusen die Myosin7a+/Atoh1-tdTomato–-Zellen im Tunnel zwischen den IHCs und den OHCs befanden (Abb. 5e). -G). Diese Ergebnisse zeigten, dass XMU-MP-1 die HC-Differenzierung nach Neomycin-Insult signifikant steigerte und die regenerierten HCs größtenteils von Sox9+-Vorläufern und nicht von Atoh1-tdTomato+-HCs unterschieden wurden (Abb. 5h, i). Die Verteilung von Sox9-tdTomato+-Zellen und Atoh1-tdTomato+-Zellen in der HC-Schicht ohne Neomycin-Schaden ist in Abb. S9a, b dargestellt.

Bei WT-Mäusen erhöhte die Zugabe von Kontrollgruppe. Umgekehrt wurde in den mit XMU-MP-1 behandelten Cochleae eine signifikant erhöhte Anzahl von Sox2+/EdU+- und Myosin7a+/EdU+-Zellen gefunden (Abb. 5l – q). Interessanterweise lagen fast alle Myosin7a+/Sox2+/EdU+-Zellen paarweise zusammen vor. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass sich die meisten mitotisch proliferierenden HCs zwischen den IHCs und OHCs befanden, also der Region, in der die Vorläuferzellen angereichert sind7 (Abb. 5n). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Regulierung der Hippo-Signalübertragung ein kontextabhängiger SC-Proliferationsregulator sein könnte, der bei geschädigten Cochleae eine deutlich stärkere SC-Proliferation induziert. Darüber hinaus waren mitotisch erzeugte HCs (EdU+/Myosin7a+/Sox2+) im Vergleich zu den intakten Cochleae deutlich erhöht (Abb. S9c, d), aber diese waren immer noch nicht der Hauptzelltyp, der aus der durch YAP-Kerntranslokation induzierten HC-Regeneration in vitro resultierte (Abb . 5q–u).

Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, war das YAP-Protein im SC-Kern nach einer Neomycin-Schädigung erhöht (Abb. 1g – i). Darüber hinaus förderte XMU-MP-1 dosisabhängig die YAP-Kerntranslokation in SCs, nicht nur im intakten Zustand (Abb. 2b – g), sondern auch im Neomycin-Schadenszustand (Abb. 5j, k), was zur Verfügung stand ein weiterer starker Beweis dafür, dass die nukleare Translokation von YAP mit der HC-Regeneration verbunden ist.

Als nächstes versuchten wir festzustellen, ob das Ausschalten von Hippo die Erzeugung überzähliger HCs durch Stimulation der YAP-Kerntranslokation auslöste. Adenovirus wurde als Vektor für eine effiziente Transfektion der Cochlea-Explantate verwendet und es wurden rekombinante Adenoviren (Ad-YAP und Ad-YAP-GFP) erzeugt, um Yap1 zu überexprimieren. Für die weitere Analyse wurde die optimale Konzentration von 3 × 109 PFU/ml Adenovirus ausgewählt (Abb. 6a – g). In den mit Ad-YAP behandelten Cochleae wurde eine deutlich erhöhte Anzahl von Myosin7a+-Zellen und Myosin7a+/EdU+-Zellen gefunden (Abb. 6h – k). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die direkte Differenzierung die HC-Regeneration im Vergleich zu mitotisch erzeugten HCs dominiert.

a Nach 6-stündiger Neomycin-Exposition wurden die Cochlea-Explantate 48 Stunden lang mit exogenem Ad-GFP/Ad-Yap-GFP kultiviert und die Transfektionseffizienz basierend auf der GFP-Fluoreszenz in Sox2+-SCs im SR analysiert. b, c GFP+/Sox2+-Zellen wurden gezählt und die Ergebnisse zeigten, dass die Transfektionseffizienz mit steigenden Adenovirus-Konzentrationen zunahm (107, 108, 109, 3 × 109 und 1010 PFU/ml). d Die Anzahl der Sox2+-SCs, die mit unterschiedlichen Adenovirus-Konzentrationen behandelt wurden, wurde berechnet. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der SCs bei hoher Konzentration leicht abnahm. e, f Um die Expression von Yap hochzuregulieren, wurden die Cochlea-Explantate nach 6-stündiger Neomycin-Insultation 48 Stunden lang mit Ad-Yap-GFP behandelt. Es wurde ein t-Test mit einer Probe durchgeführt und zeigte, dass YAP bei einer Konzentration von 3 × 109 PFU/ml Adenovirus signifikant erhöht war und die Verteilung von YAP im Zellkern signifikant erhöht war. g Das relative mRNA-Expressionsniveau des Hippo-Signals und der nachgeschalteten Zielgene nach Ad-Yap-GFP-Behandlung und eine Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest wurden durchgeführt, um die signifikanten Unterschiede aufzuzeigen. h–k Nach 6-stündiger Neomycin-Exposition wurden die Cochlea-Explantate 7 Tage lang mit Ad-mus-Yap1 oder Ad-null kultiviert und die ganze Zeit über 10 μM EdU zugegeben, um proliferierende Zellen aufzuspüren. In der Kontrollgruppe mit Ad-Null-Behandlung wurden keine proliferierenden HCs oder SCs festgestellt. In der Ad-mus-Yap1-Behandlungsgruppe gab es signifikant mehr EdU+ SCs und HCs von der apikalen zur basalen Wende, analysiert mit Zwei-Wege-ANOVA und anschließendem Sidak-Mehrfachvergleichstest. Im Vergleich zu den Kontrollen war die Anzahl der HCs von der apikalen zur basalen Windung signifikant erhöht, analysiert mit Zwei-Wege-ANOVA und anschließendem Sidak-Mehrfachvergleichstest. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm in (b) und (h), Maßstabsbalken = 10 μm in (e).

In unserer vorherigen Studie haben wir herausgefunden, dass eine koordinierte Regulierung der Wnt-Aktivierung und der Notch-Hemmung die HC-Regeneration in der postnatalen Cochlea von Mäusen fördern kann7,35. Durch die Analyse der Transkripte von Cochleae nach einer Neomycin-Verletzung zeigte die Proteininteraktionsnetzwerkanalyse mit STRING, dass die Expression von Hippo-, Notch- und Wnt-Signalweg-bezogenen Genen im Regenerationsprozess deutlich variierte (Abb. 7a). Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die Hippo-Hemmung mit einer Hochregulierung von Genen im Zusammenhang mit der HC-Transformation (Atoh1, Brn3.1), dem Notch-Signalweg (Jag1, Hes1 und Hes5) sowie Yap/Taz und seinen nachgeschalteten Effektorgenen (ACTG) einherging und Amotl2) in den mit XMU-MP-1 behandelten Cochleae nach Neomycin-Insult (Abb. 7b).

eine Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalyse unterschiedlich exprimierter Gene der Hippo-, Notch- und Wnt-Signalwege. Lila Linien zeigen Interaktionen zwischen Hippo- und Wnt-Genen an, und orange Linien zeigen Interaktionen zwischen Hippo- und Notch-Genen an. Die Farbe der Knoten zeigt die Faltungsänderung der Genexpression an. b Die Cochlea-Explantate von P2-Wildtyp-Mäusen wurden geerntet und dann kultiviert. Nach 6-stündiger Neomycin-Exposition wurden die Explantate 24 Stunden lang mit XMU-MP-1 oder DMSO kultiviert. Es werden verwandte mRNA-Expressionsniveaus zwischen mit XMU-MP-1 behandelten Gruppen und Kontrollen angezeigt, und eine Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest wurde durchgeführt, um die signifikanten Unterschiede aufzuzeigen. c Die Cochlea-Explantate von P2 WT-Mäusen wurden geerntet und dann kultiviert. Nach 6-stündiger Neomycin-Exposition wurden die Explantate 3 Tage lang mit exogenen Verbindungen (einschließlich XMU-MP-1, BIO oder DAPT) oder 0,5 % DMSO kultiviert und die ganze Zeit über 10 μM EdU zugegeben, um proliferierende Zellen aufzuspüren. d–g Die Gesamtzahl der HCs und EdU+ HCs unterschied sich nicht signifikant zwischen der mit XMU-MP-1 behandelten und der mit XMU-MP-1/BIO behandelten Gruppe. e, h, i Die Anzahl der regenerierten HCs war in der mit XMU-MP-1/DAPT behandelten Gruppe im Vergleich zur mit XMU-MP-1 behandelten Gruppe signifikant erhöht. j Eine Zwei-Wege-ANOVA mit anschließendem Mehrfachvergleichstest nach Dunnett wurde durchgeführt und zeigte, dass die Hochregulierung der Wnt-Signalisierung durch BIO die Proliferation von SCs fördern kann. Allerdings erzeugte die Koregulierung von XMU-MP-1/DAPT mehr HCs, einschließlich EdU+-HCs, und im GER wurde eine große Anzahl proliferierender SCs gefunden. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken = 20 μm.

Darüber hinaus untersuchten wir die synergistischen/antagonistischen Effekte des Ausschaltens von Hippo mit anderen Signalen (Abb. 7c). Einige proliferierende SCs und regenerierte HCs im SR wurden beobachtet, wenn die Hippo-Signalisierung allein ausgeschaltet war (Abb. 7d, e, j), während eine große Anzahl proliferierender SCs (im SR und GER) und nahezu keine direkt differenzierten HCs beobachtet wurden wenn der Wnt-Weg allein (mit BIO) aktiviert wurde (Abb. 7f, j). Wir beobachteten einige proliferierende SCs und regenerierte HCs im SR, als das Ausschalten von Hippo mit der Wnt-Aktivierung kombiniert wurde (Abb. 7g, j). Die Proliferation von SCs in der kombinierten Hippo-Inaktivierungs-/Wnt-Aktivierungsgruppe war im Vergleich zur alleinigen Aktivierung des Wnt-Signalwegs signifikant gehemmt, ähnelte jedoch der alleinigen Regulierung des Hippo-Signalwegs, insbesondere in der SR. Unterdessen waren die direkt differenzierten HCs von der Wnt-Aktivierung nicht betroffen und ihre Anzahl ähnelte derjenigen, die beim alleinigen Ausschalten der Hippo-Signalisierung beobachtet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es keinen offensichtlichen synergistischen Effekt der Wnt-Aktivierung und Hippo-Inaktivierung gibt.

Schließlich wurden im SR einige proliferierende SCs und eine große Anzahl direkt differenzierter HCs beobachtet, wenn der Notch-Signalweg allein inhibiert wurde (Abb. 7h, j), und viele proliferierende SCs und regenerierte HCs wurden beobachtet, wenn die Hochregulierung von Hippo mit der Notch-Unterdrückung kombiniert wurde (mit DAPT) (Abb. 7I, j). Insbesondere war die Proliferation von SCs im SR im Vergleich zu der mit Notch-Hemmung allein beobachteten deutlich verringert, SC-Proliferation wurde jedoch hauptsächlich im GER gefunden. Außerdem stieg die Zahl der direkt differenzierten HCs im Vergleich zum alleinigen Ausschalten von Hippo deutlich an. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es einen signifikanten synergistischen Effekt des Notch-Signals auf den Hippo-Signalweg gab, insbesondere bei der Förderung der direkten Differenzierung von SCs in HCs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hippo/Wnt/Notch-Regulation, insbesondere die Kombination von Hippo und Notch, eine wichtige Rolle bei der HC-Regeneration im Innenohr zu spielen scheint.

Die Hippo-YAP-Signalübertragung ist ein wichtiger Regulator für die Gewebehomöostase, die Organgröße und Stammzellen36. Unsere vorherige RNA-Sequenzierungsanalyse zwischen Neomycin-behandelten und intakten Lgr5+-Vorläufern ergab, dass Bmpr2, Wnt7a und Fzd7 unter den Hippo-Signalweg-Genen hochreguliert waren, während Id1, Id2 und Id3 herunterreguliert waren. In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf die Hippo-Signalisierung und es wurde gezeigt, dass 56 Hippo-bezogene Gene mit HC-Schäden und Selbstreparaturprozessen assoziiert sind. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die biologischen Prozesse der Schädigung und Reparatur gleichzeitig in den beschädigten Cochleae abliefen.

Als kontextabhängiger Regulator ist die Hippo-Signalübertragung an der Zellproliferation, -differenzierung und -apoptose in verschiedenen Zellsubtypen beteiligt38. YAP ist als Effektormolekül des Hippo-Signalwegs für bestimmte Zellspezifikationen in den sehr frühen Phasen der Embryonalentwicklung erforderlich20,39. Gnedeva et al. charakterisierten die Rolle von YAP bei der Aufrechterhaltung des proliferativen Zustands des Organs von Corti-Vorläufern vor der Etablierung der postmitotischen prosensorischen Domäne25. Als Reaktion auf eine Schädigung kann die Hippo-unabhängige Signalübertragung die Wirkung von YAP fördern, um eine maligne Transformation zu verhindern40. Hier zeigten wir das intrazelluläre Muster von YAP bei neugeborenen Mäusen (P2), wobei YAP hauptsächlich im Zytoplasma verteilt war und nur schwache Signale im Zellkern auftraten. Die zytoplasmatisch-nukleäre YAP-Translokation wurde durch Neomycin initiiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die nukleare Akkumulation von YAP eine wichtige Rolle im Prozess der HC-Schädigung und Selbstreparatur spielen könnte und dass die Regulierung der nuklearen YAP-Akkumulation für die HC-Regeneration nach einer Schädigung von entscheidender Bedeutung sein könnte.

Die Hippo-Signalübertragung spielt durch biochemische Rückkopplungsschleifen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Organgröße19,41. Es wurde vielfach berichtet, dass Hippo-Signale die Organgröße regulieren und homöostatische Werte erreichen, indem sie die Proliferation, das Überleben und die Differenzierung im Lebergewebe von Säugetieren modulieren42,43,44,45. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde die Rolle des Yap/Tead-Transkriptionsfaktorkomplexes, dem Effektormolekül des Hippo-Signalwegs, bei der Erhaltung von Innenohr-Vorläuferzellen während der Entwicklung hervorgehoben25,26. Andere Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung von YAP in postnatalen Kardiomyozyten die Kardiomyozytenexpansion bei der therapeutischen Myokardregeneration stimulieren kann46,47. Hier berichteten wir über die Rolle der Yap-Expression und -Lokalisierung nach HC-Schädigung in Cochleazellen von neugeborenen Säugetieren. Die nachgeschalteten Gene des Hippo-Signalwegs wurden durch XMU-MP-1 hochreguliert, und dies könnte in engem Zusammenhang mit der SC-Reprogrammierung und dem HC-Regenerationsprozess stehen.

Es wurde berichtet, dass der Verlust von Upstream-Kinasen oder die Aktivierung von YAP das Wachstum und die Zellschicksalentscheidungen in Vorläuferzellen regulieren können39,48. Um die Wirkung des Hippo-Signalwegs im Innenohr zu untersuchen, haben wir den Hippo-Signalweg pharmakologisch gehemmt und so die YAP-Kerntranslokation in vitro induziert. Darüber hinaus haben wir Mst1/2-bedingte Knockout-Mäuse eingesetzt, um die Rolle der Hippo-Hemmung im Innenohr zu überprüfen in vivo. Wir beobachteten eine Reihe proliferierender SCs, was mit ihren bekannten Funktionen bei der Regulierung des Wachstums und der Entwicklung anderer Organe übereinstimmt20. Noch wichtiger ist, dass bei transgenen Mäusen in vivo eine proliferative Erzeugung und direkte Differenzierung von HCs von SCs beobachtet wurde und die nukleare YAP-Translokation die Neomycin-geschädigten HCs in vitro wieder auffüllen konnte. Insbesondere waren über 80 % der erhöhten HCs nicht proliferativ, was zeigt, dass die direkte Differenzierung der dominierende Prozess der HC-Erzeugung als Reaktion auf die Hippo-Hemmung war und dass dies möglicherweise eng mit der begrenzten Proliferation von SCs zusammenhängt. Darüber hinaus haben wir Mst1fl/fl/Mst2fl/fl verwendet; Sox9-CreERT2/+; Rose26-tdTomato/+-Mauslinie, um zu zeigen, dass fast alle überzähligen HCs von Sox9+-SCs stammten. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Hippo-Hemmung die SC-Proliferation fördern und die Bildung überzähliger HC induzieren kann, indem das dynamische Gleichgewicht zwischen verschiedenen Zellsubtypen im Innenohr aufrechterhalten wird. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die YAP-Kerntranslokation eine stärkere mitotische Erzeugung und eine direkte Differenzierung in HCs auslösen könnte, um die Neomycin-geschädigten HCs wieder aufzufüllen, was ein durch Hippo-Signale regulierter Rückkopplungsmechanismus sein könnte. Die HC-Regeneration führte zu einer verringerten Anzahl von SCs und induzierte somit eine SC-Proliferation, die wiederum zur neuen HC-Generierung führte 49 . Diese Prozesse existieren möglicherweise nicht unabhängig voneinander, sondern beeinflussen sich möglicherweise gegenseitig durch ein dynamisches Gleichgewicht innerhalb eines geschlossenen Kreislaufs.

Es ist bemerkenswert, dass eine Schädigung durch Neomycin zusammen mit der Inaktivierung von MST1/2-Kinasen durch XMU-MP-1 dosisabhängig die Erfassung des Schicksals sensorischer Zellen induziert, hauptsächlich durch direkte Differenzierung von SCs, begleitet von einigen EdU+ HCs. Allerdings konnten wir in den unbeschädigten Cochleae mit MST1/2-Knockout durch die transgene Methode keine ausgedehnte Zellproliferation feststellen, mit Ausnahme einer kleinen Anzahl proliferierter SCs oder unreifer überzähliger HCs. Wir stellten die Hypothese auf, dass dieser Widerspruch auf den Unterschied zwischen der Neomycin-geschädigten und der intakten Mikroumgebung zurückzuführen sein könnte. Wie bereits berichtet, könnten Schäden einige HC-Regenerationsmechanismen auslösen, insbesondere bei Nicht-Säugetierarten wie Vögeln und Fischen50,51. Im Gegensatz dazu können Säugetier-HCs nicht spontan regeneriert werden. In der vorliegenden Studie kommen wir zu dem Schluss, dass Hippo-off durch MST1/2-Hemmung oder Yap-Überexpression eine YAP-Kernakkumulation induziert, insbesondere in SCs, was eine kleine Anzahl überzähliger HCs ohne Neomycin induziert, oder dass die Anzahl der HCs mit Neomycin-Verletzung erhöht wird vitro. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hippo-Signalisierung im beschädigten Zustand einige Barrieren in SCs beseitigen könnte, um sie dazu zu bringen, sich direkt in HCs zu differenzieren. Dieser Mechanismus muss in Zukunft weiter untersucht werden.

Strukturell gibt es neuronale Verbindungen zwischen HCs und den Hörzentren des Gehirns. Im Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+-Mausmodell fanden wir heraus, dass neu erzeugte HCs das Neuritenwachstum fördern konnten. Wichtig ist, dass die Bildung von Nervenfasern in vivo beobachtet wurde, was die Hypothese stützt, dass die Bildung überzähliger HCs in situ Verbindungen zwischen HCs und Neuronen anzieht, und dies legt nahe, dass die neuen HCs neuronale Verbindungen rekonstruieren und somit das Potenzial zur Wiederherstellung des Hörvermögens haben könnten Verlust. Allerdings nimmt die Regenerationsfähigkeit von HCs mit zunehmendem Alter in vivo und in vitro schnell ab12,13. Zukünftige Arbeiten sollten sich daher auf das Verständnis der diesen Prozessen zugrunde liegenden Mechanismen konzentrieren, um neue Strategien zur Wiederherstellung des Gehörs bei Säugetieren zu entwickeln.

In einer früheren Studie wurde berichtet, dass die Mechanoaktivierung von YAP/TAZ die epidermale Stammfunktion durch Hemmung des Notch-Signalwegs fördert52, und eine umfangreiche Arbeit hat gezeigt, dass die Hippo-, Wnt- und Notch-Signalwege nicht unabhängig voneinander funktionieren und sich gegenseitig beeinflussen können andere47,53,54,55. Es wurde auch berichtet, dass die Aktivierung des Wnt-Signals die SC-Proliferation förderte und dass die Hemmung des Notch-Signals die HC-Regeneration stimulierte7,35. Hier untersuchten wir den Einfluss dieser beiden klassischen Signalwege auf die Funktionen von Hippo bei der Förderung der Regeneration. Die Wechselwirkung zwischen YAP- und Notch-Signalisierung beeinflusst die Zellentwicklung, Zelldifferenzierung, Entscheidungen über das Zellschicksal, Morphogenese, Entzündung, epitheliale Stromainteraktionen und groß angelegte Genoszillationen56. Es wurde berichtet, dass YAP/TAZ die Jagged-1-Expression aktiviert und somit die Notch-abhängige Differenzierung der glatten Muskulatur in der Neuralleiste fördert55. In unserer Studie gab es im SR bei kombinierter Regulierung der Wnt- und Hippo-Signalwege im Vergleich zur alleinigen Regulierung von Hippo keine offensichtlich erhöhte SC-Proliferation oder HC-Regeneration. Als Reaktion auf die kombinierte Regulierung der Notch- und Hippo-Signalwege kam es jedoch im SR zu einer stärkeren SC-Proliferation und einer stärkeren HC-Regeneration im Vergleich zur gleichzeitigen Regulierung eines einzelnen Signalwegs. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Hemmung des Notch-Signalwegs einen synergistischen und positiven regulatorischen Effekt auf die Hippo-Signalübertragung hat, und wir werden weitere Untersuchungen zur sequentiellen Regulierung dieser Signalwege durchführen, um diese Annahmen direkt zu überprüfen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die YAP-Kernakkumulation als Reaktion auf die Hippo-Hemmung eine milde SC-Proliferation fördern und bei neugeborenen Mäusen eine überzählige HC-Erzeugung induzieren kann. Sie fördert insbesondere die direkte SC-Transdifferenzierung zusammen mit Neomycin-Schäden, hauptsächlich in den apikalen bis mittleren Windungen der Cochlea. Wir liefern zahlreiche Beweise für die positive Wirkung der Hippo-Hemmung auf die HC-Regeneration und zeigen den synergistischen Effekt mit den Notch- und Wnt-Signalwegen, der hoffentlich zu neuen Strategien zur Förderung der SC-Proliferation, der HC-Regeneration und der Wiederverbindung mit Neuronen im Inneren von Säugetieren führen wird Ohr.

Alle transgenen Mäuse (siehe Tabelle 1) wurden vom Jackson Laboratory erhalten. Zur Cre-Aktivierung wurden 15 µl Tamoxifen (Sigma), gelöst in Maisöl, intraperitoneal in P1–2-Mäuse injiziert (40 mg/ml). Zum Nachweis proliferierender Zellen wurden 20 µl des Thymidinanalogons EdU (Click-iT EdU Imaging Kit; Invitrogen) intraperitoneal in neugeborene P2–7-Mäuse injiziert (5 mg/ml).

Wir haben alle relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und Forschung eingehalten. Alle Tierversuche wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Fudan-Universität genehmigt wurden, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren und ihr Leiden zu verhindern.

Transgene Mäuse wurden mit genomischer DNA, die mit dem Viagen DirectPCR DNA Extraction System (Viagen) aus Schwanzspitzen extrahiert wurde, genotypisiert. Die Genotypisierungsprimer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Gesamt-RNA wurde aus der Cochlea mit der Anlage der Stria vaskularis, dem Modiolus und der Tektorialmembran mit TRIzol (Ambion) extrahiert. cDNA-Synthese und qPCRs wurden mit dem PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara) und TB GreenTM Premix Ex TaqTM II (Takara) durchgeführt. Jede PCR wurde dreifach durchgeführt und die relative Quantifizierung der Genexpression wurde unter Verwendung der ΔΔCT-Methode mit Gapdh als endogener Referenz durchgeführt. Primerpaare wurden mit der Online-Software Primer3 entworfen und die Sequenzen sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Cochleae neugeborener P2-Mäuse wurden unter sterilen Bedingungen isoliert, wobei die Anlage der Stria vaskularis, des Modiolus und der Tektorialmembran mit einer feinen Pinzette entfernt und dann auf 10 cm lange Deckgläser gelegt wurden, die mit Corning® Cell-Tak™ Zell- und Gewebekleber vorbeschichtet waren. Ganze Organe wurden in DMEM/F12-Medium, ergänzt mit N2/B27 (Invitrogen) und Ampicillin-Natriumlösung (Sangon Biotech), in Petrischalen mit vier Vertiefungen kultiviert. Zur HC-Insultation wurde nach 12-stündiger Kultivierung Neomycin (1 mM, Sigma) und 10 µM EdU zugegeben, um proliferierende Zellen nachzuweisen. Im Cochlea-Kulturmodell in vitro wurden 1 mM und 5 mM XMU-MP-1 (Selleck), 5 µM DAPT (N-[N-(3,5-Difluorphenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycin t- Butylester, ein γ-Sekretase-Sekretase-Inhibitor) und 5 µM BIO (6-Bromindirubin-3'-oxim) wurden hinzugefügt, um die biologische Aktivität der Wnt- und Notch-Signalwege zu regulieren.

Um die rekombinanten Yap-Überexpressions-Adenovirus-Vektoren zu konstruieren, wurden der pAd/CMV/V5-DEST Gateway®-Vektor, der pAd/PL-DEST Gateway®-Vektor und 293 Zelllinien (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) hergestellt. Maus-cDNA für Yap (NM_001171147CDS) wurde in die adenoviralen Vektoren eingefügt. Die verdauten Vektor- und Insertsegmente wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Es wurde eine umfassende Extraktion und Verpackung der viralen Plasmide durchgeführt, gefolgt von der Sammlung und Amplifikation. Schließlich wurde ein rekombinantes Adenovirus mit einem Titer von 1,2 × 1010 PFU/ml erhalten. Für die Transfektion von Cochlea-Explantaten wurde rekombinantes Adenovirus (Ad-null, Ad-GFP, Ad-YAP und Ad-YAP-GFP) zum Medium gegeben und 48 Stunden lang inkubiert. Die Konzentrationen des rekombinanten Virus betrugen 107, 108, 109, 3*109 und 1010 PFU/ml. Die Gewebe wurden für die immunhistochemische Markierung vorbereitet und 7 Tage nach der Adenovirus-Inkubation analysiert.

Die Gewebe wurden 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Gewebe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in eine Blockierungslösung bestehend aus 10 % Eselserum und 1 % Triton-X100 in PBS bei pH 7,4 eingetaucht. Die Primärantikörper und Sekundärantikörper wurden über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer in 1 % Triton-X100 in PBS verdünnt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Gewebe in ein lichtbeständiges Fluoreszenz-Eindeckmedium eingelegt und abgedeckt. Die in unseren Experimenten verwendeten Primärantikörper waren Kaninchen-Anti-Myosin7a (1:500-Verdünnung) (Proteus Biosciences), Ziegen-Anti-Sox2 (1:500-Verdünnung) (Abcam) und Maus-Anti-YAP (1:50-Verdünnung) (Santa). Cruz). HC-Bündel wurden mit Phalloidin (1:500-Verdünnung) (Life Technologies) markiert, Nervenfasern wurden mit Tuj1 (1:500-Verdünnung) (Abcam) markiert und Kerne wurden mit DAPI (1:500-Verdünnung) (Sigma) markiert. Das FM1-43-Aufnahmeexperiment wurde mit FM1-43FX durchgeführt, einem fixierbaren Analogon der FM1-43-Membranfärbung (Verdünnung 1:500) (Invitrogen).

Die Cochlea wurde unmittelbar nach der Anästhesie der Maus mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert. Die Gewebe wurden dann für die SEM in 2,5 % Glutaraldehyd getaucht. Die REM-Proben wurden in 1 % phosphatgepuffertem OsO4 nachfixiert, in einer abgestuften Ethanolreihe dehydriert, getrocknet, auf ein Aluminiumblech montiert und mit Gold/Palladium besprüht. Die SEM wurde mit einem ZEISS GeminiSEM 300 (Deutschland) durchgeführt. Die Fotos werden in Pseudofarbe dargestellt.

Um die Funktionen nativer HCs in WT-Mäusen und neu erzeugter HCs in Mst1fl/fl/Mst2fl/fl zu bewerten; Sox9-CreERT2/+; Rosa26-tdTomato/+ Mäusen führten wir Patch-Clamp-Aufnahmen in herausgeschnittenen Corti-Organen durch. Für diese elektrophysiologischen Experimente wurden Cochleae von P7-WT-Mäusen oder transgenen Mäusen frisch in DMEM/F12 präpariert und dann in extrazellulärer Lösung gebadet, die (in mM) enthielt: 135 NaCl, 5,8 KCl, 1,3 CaCl2, 0,9 MgCl2, 0,7 NaH2PO4⋅H2O, 10 HEPES, 5,6 D-Glucose, 2 Na-Pyruvat (309 mOsm, pH wurde mit NaOH auf 7,40 eingestellt). Die apikalen und mittleren Windungen der Cochleae wurden dann mit Zell-TeK (Sigma) auf dem Glas immobilisiert und in die Aufnahmekammer überführt. Für die Aufzeichnung wurden zufällige native OHCs, SCs in der Nähe der IHCs und regenerierte HCs in der apikalen Kurve ausgewählt.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen wurden mit der Patchmaster-Software (HEKA Electronics) und dem EPC10/2-Verstärker (HEKA Electronics, Lambrecht Pfalz, Deutschland) durchgeführt. Patchpipetten mit 3–5 MΩ wurden aus Borosilikatglaskapillaren (Sutter) gezogen. Die Pipettenfülllösung enthielt (in mM): 112 K-Methansulfonat, 20 KCl, 10 HEPES, 2 Ethylenglykoltetraessigsäure, 10 Na-Phosphokreatin, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP (285 mOsm, pH wurde auf eingestellt). 7,40 mit KOH). Die Proben wurden in einem aufrechten Mikroskop (Olympus) mit Nomarski-Differential-Interferenz-Kontrastoptik (60x Wasserimmersionsobjektive) beobachtet.

Die Zellen wurden zur Spannungsbegrenzung auf –80 mV gehalten, und für die Aufzeichnung des gesamten K+-Stroms verwendeten wir Spannungsschritte von –120 mV bis +50 mV bei 10 mV pro Schritt. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt und die Spannungen wurden offline für ein gemessenes Flüssigkeitsübergangspotential von 6 mV (K intern) korrigiert.

Elektrophysiologische Daten wurden mit der Igor-Software (Pro 6.22) und GraphPad Prism6 analysiert. Für die K+-Stromanalyse wurden Daten akzeptiert, wenn Rs nicht größer als 20 MΩ war. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben.

Sechs bis acht kultivierte Cochleae wurden gesammelt, um die Gesamt-RNA mit dem AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (QIAGEN) zu isolieren, wie in der vorherigen Studie32 berichtet.

Die vorläufige Verarbeitung der Rohdaten wurde mit Casava 1.8 (Illumina) durchgeführt und Adapter und minderwertige Basen wurden mit trimmomatic (Version 0.23) zugeschnitten. Zugeschnittene Messwerte für jede Probe wurden mithilfe von Hisat250 mit dem Genom von Mus musculus UCSC mm10 abgeglichen. Ausgerichtete Lesevorgänge wurden mit HTseq (doi:10.1093/bioinformatics/btu638) gemäß der UCSC mm10-Annotation gezählt. Die Analyse der differentiellen Expression zwischen Bedingungen wurde mit dem DESeq2 R-Paket durchgeführt (Love et al., 2014). Gene mit einem angepassten p-Wert (padj) < 0,05 und einer Fold Change > 1,5 wurden als differenziell exprimiert angesehen. Die genontologische Analyse signifikant unterschiedlich exprimierter Gene wurde mit DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) durchgeführt. Zur Generierung von Heatmaps wurde das Paket Pheatmap R verwendet. Die Netzwerkanalyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) unterschiedlich exprimierter Gene in den Hippo-, Notch- und Wnt-Signalwegen wurde mit der STRING-Software durchgeführt.

In der funktionalen Anreicherungsanalyse. Der Grenzwert von 0,1 für die Falscherkennungsrate wurde verwendet, um potenziell beteiligtere Pfade einzubeziehen.

Das Gesamtprotein der Cochleae wurde mit RIPA-Lysepuffer (Beyotime), ergänzt mit PMSF (Beyotime), isoliert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Beyotime) gemessen, und die Proteine ​​wurden auf einem BeyoGel™ Plus Precast PAGE Gel für das Tris-Gly-System (Beyotime) aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (Beyotime) übertragen. Die Membranen wurden mit 10 % fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und dann geblottet über Nacht mit Primärantikörpern bei 4 °C. Die primären Antikörper waren wie folgt: Kaninchen-Anti-Yap (1:1000-Verdünnung) (CST), Kaninchen-Anti-Phospho-Yap (1:1000-Verdünnung) (Ser127) (CST), Kaninchen-Anti-LATS1 (1:1000-Verdünnung) (CST), Kaninchen-Anti-Phospho-LATS1 (1:1000-Verdünnung) (Thr1079) (CST), Kaninchen-Anti-Cyr61 (1:500-Verdünnung) (Santa Cruz) und Ziegen-Anti-CTGF (1:500-Verdünnung) ( Santa Cruz). Alle Blots stammen aus demselben Experiment und wurden parallel verarbeitet.

Zur Aufnahme fluoreszierender Bilder wurde ein konfokales SP8-Mikroskop verwendet. Alle Bilder wurden mit ImageJ, Adobe Photoshop CS6 und Illustrator CC beschriftet und digital verarbeitet. Das schematische Diagramm wurde mit der CDR-Software erstellt. Die Zellzahlen in den Fluoreszenzbildern wurden mit ImageJ durchgeführt. Die Gesamtzahl der HCs, SCs, EdU+-Zellen und doppelt gefärbten Zellen wurde in 200-µm-Regionen der Cochlea von der apikalen, mittleren und basalen Windung aus gezählt.

Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. T-Tests mit einer Stichprobe und zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests wurden verwendet, um die statistische Signifikanz beim Vergleich zweier Gruppen zu bestimmen, und beim Vergleich von mehr als zwei Gruppen wurden eine einfaktorielle und zweifaktorielle ANOVA verwendet. Ein Wert von p < 0,05 war statistisch signifikant. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die RNA-Sequenzierungsanalysedaten wurden im öffentlichen GEO-Datenbank-Repository (Zugangsnummer GSE213784) hinterlegt.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (Nr. 2017YFA0103900), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82192860, 81830029, 81900931, 81970879), der National Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1411800) unterstützt. das Excellent Doctors-Excellent Clinical Researchers Program (Nr. SYB202008, SZA202002), das „Sailing Program“ (19YF1406000) und die Forschungsprojekte des Shanghai Municipal Health Committee (2020YJZX0110, 2022XD059).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xiaoling Lu, Huiqian Yu, Jiaoyao Ma, Kunkun Wang.

HNO-Institut und Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Augen- und HNO-Krankenhaus, State Key Laboratory of Medical Neurobiology und MOE Frontiers Center for Brain Science, NHC Key Laboratory of Hearing Medicine (Fudan University), Fudan University, 200031, Shanghai, VR China

Xiaoling Lu, Huiqian Yu, Jiaoyao Ma, Kunkun Wang, Luo Guo, Yanping Zhang, Huawei Li und Shan Sun

Xiamen University School of Life Sciences, 361100, Xiamen, VR China

Boan Li & Zehang Zhao

Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, 200032, Shanghai, VR China

Huawei Li

Die Institute of Brain Science und das Collaborative Innovation Centre for Brain Science, Fudan University, 200032, Shanghai, China

Huawei Li

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HL und SS haben die Studien entworfen; XL, HY, KW, JM und YZ führten die Experimente durch; XL, KW und HY haben die Daten erfasst; XL, HY, LG und SS analysierten die Daten; HL stellte Reagenzien zur Verfügung; und XL, HY und SS haben das Manuskript geschrieben. XL, HY, JM und KW haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Huiqian Yu, Huawei Li oder Shan Sun.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lu, X., Yu, H., Ma, J. et al. Der Verlust der Mst1/2-Aktivität fördert die Bildung nicht-mitotischer Haarzellen im neugeborenen Corti-Organ. npj Regen Med 7, 64 (2022). https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

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Eingegangen: 17. Januar 2022

Angenommen: 10. Oktober 2022

Veröffentlicht: 25. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

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