Das Proteom des Vestibularhaars der Maus bündelt sich im Laufe der Entwicklung

Jul 17, 2023

Scientific Data Band 2, Artikelnummer: 150047 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Entwicklung des Wirbeltierhaarbündels ist ein präzise orchestrierter Vorgang, der in der Bildung einer streng geordneten Anordnung aktinreicher Stereozilien und eines einzelnen axonemalen Kinociliums gipfelt. Um zu verstehen, wie sich die Proteinzusammensetzung des Bündels während der Entwicklung ändert, isolierten wir Bündel aus jungen (postnatalen Tagen P4–P6) und reifen (P21–P25) Utrikeln von Mäusen mithilfe der Twist-off-Methode und charakterisierten dann ihre Proteinbestandteile mithilfe der Flüssigkeitschromatographie Tandem-Massenspektrometrie mit datenabhängiger Erfassung. Mit MaxQuant und markierungsfreier Quantifizierung haben wir die relative Häufigkeit von Proteinen in beiden Bündeln und im gesamten Utrikel gemessen; Der Vergleich der Proteinhäufigkeit zwischen den beiden Fraktionen ermöglicht die Berechnung der Anreicherung in Bündeln. Diese Daten, die über ProteomeXchange mit der Kennung PXD002167 verfügbar sind, werden für die Untersuchung der in Vestibularbündeln von Säugetieren vorhandenen Proteine ​​und der Veränderung ihrer Konzentrationen im Laufe der Entwicklung nützlich sein.

Designtyp(en)

Parallelgruppendesign • Replikatdesign • Organismusentwicklungsdesign

Messart(en)

Profilierung der Proteinexpression

Technologietyp(en)

Massenspektrometrie-Assay

Faktortyp(en)

Stadium des Lebenszyklus

Probenmerkmal(e)

Mus musculus • Utrikel des häutigen Labyrinths

Maschinenzugängliche Metadatendatei, die die gemeldeten Daten beschreibt (ISA-Tab-Format)

Das Haarbündel der Wirbeltiere, das Sinnesorganell des Innenohrs, ist für die Mechanotransduktion notwendig, bei der mechanische Signale wie Geräusche und Kopfbewegungen im Nervensystem in elektrische Erregung umgewandelt werden. Das Bündel ragt aus der apikalen Oberfläche einer sensorischen Haarzelle hervor und besteht aus Dutzenden bis Hunderten von mit Aktin gefüllten Stereozilien und einem einzigen echten axonemalen Zilium, dem Kinocilium1. Um zu verstehen, wie das Bündel funktioniert und wie es zusammengesetzt ist, ist die Kenntnis der Zusammensetzung des Bündels erforderlich. Die Massenspektrometrie hat sich als beste Hochdurchsatzmethode zur Charakterisierung der Proteinzusammensetzung erwiesen. Während wir über ein ausgezeichnetes Verständnis des Proteoms der Vestibularhaarbündel von Küken2 sowie über eine eingeschränktere Sicht auf die Cochleabündel von Küken3 verfügen, ist die Bestimmung der Proteinzusammensetzung der Haarbündel von Mäusen ein wesentlicher nächster Schritt. Das Innenohr der Maus ist nicht nur ein hervorragendes Modell zur Untersuchung menschlicher Taubheit und Gleichgewichtsstörungen, sondern die vielen genetischen und molekularen Werkzeuge, die der Maus zur Verfügung stehen, ermöglichen auch viele Experimente, die in anderen Organismen nicht durchgeführt werden können. Darüber hinaus ist relativ wenig darüber bekannt, wie sich die Proteinzusammensetzung des Bündels während der Entwicklung verändert; Beispielsweise kommen Proteine, die Schlüsselschritte bei der Verlängerung der Stereozilien steuern, möglicherweise nur in jungen Bündeln vor.

Haarbündel sind rar; In jedem Hör- oder Vestibularorgan gibt es nur wenige Tausend Haarzellen, und bei Hühnern (und Mäusen; siehe unten) machen die Haarbündel weniger als 1 % des gesamten Proteins im Organ aus2. In den Bündeln eines Maus-Utrikels sind nur ca. 2 ng Aktin vorhanden4, und Aktin macht >50 % des gesamten Bündelproteins aus (siehe unten). Darüber hinaus sind viele der interessantesten Moleküle in den Stereozilien in einer molaren Häufigkeit von <10-5 der von Aktin vorhanden – weniger als ein Attomol pro Ohr. Biochemische Experimente zur Charakterisierung des Proteoms des Bündels erfordern daher eine umfassende Präparation, spezielle Reinigungsmethoden und den Einsatz empfindlicher Nachweismethoden.

Die Proteinmassenspektrometrie hat sich als einzige Technik herausgestellt, die über die erforderliche Empfindlichkeit und den dynamischen Bereich verfügt, um ein breites Spektrum an Proteinen aus Haarbündeln zu analysieren. Während sich Top-Down-5 und datenunabhängige6 Methoden zur Proteinanalyse wahrscheinlich in Zukunft ausreichend für die Analyse von Bündelproteinen entwickeln werden, bietet die datenabhängige Shotgun-Massenspektrometrie7 derzeit einen gut charakterisierten Ansatz, der die Erkennung sowohl von Low- als auch High-Protein-Analysen ermöglicht. Häufigkeit von Proteinen, wenn auch letztendlich durch den dynamischen Bereich von Massenspektrometern begrenzt. Darüber hinaus wurden die Methoden zur Quantifizierung von Proteinen mithilfe von Massenspektrometriedaten verbessert und ermöglichen eine genaue Messung der relativen Proteinhäufigkeit mithilfe der Intensitäten von Eltern- oder Tochterionen8,9. Zusammen ermöglichen diese Techniken eine gründliche Charakterisierung des Proteoms des Haarbündels.

Wir verwendeten die Twist-off-Haarbündel-Reinigungstechnik10, die Bündel in einer Matrix aus Agarosegel einfängt, um Mausbündel aus Utrikeln, einem der Vestibularorgane, zu isolieren (Abb. 1a, b). Vier biologische Replikate von Bündeln, jeweils aus 100 Ohren, wurden von unreifen (~P5) und jungen erwachsenen (~P23) Mäusen gesammelt. Gereinigte Bündelproteine ​​wurden einer Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unter Verwendung eines Orbitrap-Massenspektrometers unterzogen. Um eine Referenz für die Untersuchung der Bündelanreicherung bereitzustellen, haben wir außerdem vier biologische Replikate von 10 Maus-Utrikeln in jedem der beiden gleichen Entwicklungsstadien analysiert. Wir identifizierten Proteine ​​mit der Andromeda-Suchmaschine und quantifizierten sie mithilfe markierungsfreier Messungen der Intensität des Vorläuferpeptids. Durch den Vergleich der relativen Häufigkeit jedes Proteins, das sowohl in den Haarbündeln als auch im Utrikel identifiziert wurde, konnten wir die Anreicherung des Proteins in den Haarbündeln bestimmen.

(a) Farbfüllung des Innenohrs der Maus mit markierten Sinnesflecken („utr“, Utriculus; „a“, Ampullen der halbkreisförmigen Kanäle; „sac“, Saccule; „coch“, Cochlea). Angepasst an Abb. 1b von Lit. 22 mit Genehmigung. (b) Phalloidin-Färbung (zum Nachweis von Aktin) einer ~50×50 μm-Region des Utrikularepithels (~100 Haarzellen, von ~3.000). Es sind Haarbündel zu sehen, die aus dem Utrikular-Sinnesepithel aufsteigen, das durch umlaufende Aktingürtel gekennzeichnet ist, die jede Zelle umgeben. (c) Arbeitsablauf. Es wurden jeweils vier biologische Replikate von P5-Bündel (BUN), P23-Bündel, P5-Utrikeln (UTR) und P23-Utrikeln hergestellt. Von den Bündelproben stammten etwa 10 % des Proteins aus dem Utrikel; Bündel machen <1 % des Proteins in der Utrikelprobe aus. Die Proteine ​​jeder der sechzehn Proben wurden mithilfe kurzer SDS-PAGE-Läufe aufgetrennt und die Spuren wurden in jeweils sechs Stücke geschnitten. Die Proben wurden reduziert, alkyliert und vor der LC-MS/MS einem Trypsinverdau unterzogen. Insgesamt wurden im Projekt 96 LC-MS/MS-Läufe durchgeführt. Peptide aus jedem Lauf wurden mit MaxQuant identifiziert; Die Daten der sechs Gelscheiben pro Protein wurden wieder zusammengeführt, sodass die endgültige Ausgabe alle aus dem einzelnen biologischen Replikat nachgewiesenen Peptide darstellte. MaxQuant gruppierte alle Proteine, die sich nicht durch eindeutige Peptide unterschieden; Unsere zusätzliche Gruppierung umfasste alle Proteine, die mindestens 20 % ihrer Peptide gemeinsam hatten. (d) Gereinigte Maus-Utrikelhaarbündel, gefärbt mit Phalloidin zum Nachweis von Aktin (Magenta) und DAPI zum Nachweis von Kernen (grün). Im Präpariermikroskop sind sowohl Bündel als auch Bereiche mit erheblicher zellulärer Kontamination zu erkennen und kontaminierende Bereiche können aus den Bündeln herausgeschnitten werden. Für das dargestellte Präparat ist der Bereich, der exzidiert werden würde, durch gestrichelte Linien dargestellt. Beachten Sie, dass eine gewisse nukleare Kontamination bestehen bleiben würde (Pfeile). (e) Protein-Immunoblot zur Abschätzung der Kontamination in Mausbündelpräparaten. Es wurde die angegebene Anzahl an Ährenäquivalenten von Bündeln (links) oder Utrikularepithelien (rechts) gemessen. Das obere Feld zeigt den Tuschefleck des Blots nach der Proteinübertragung; Beachten Sie die Banden, die Aktin und kontaminierendem Keratin in der Bündelspur entsprechen. Die unteren beiden Felder sind Protein-Immunoblots. Selbst bei Material im Wert von 15 Ähren wurden der Plasmamembranmarker Na+/K+-ATPase und das Intermediate-Filament-Protein Vimentin in der Bündelpräparation nicht nachgewiesen.

Wir haben vier Probensätze gesammelt, darunter gereinigte Maushaarbündel von Mäusen am 4.–6. postnatalen Tag (bezeichnet als „P5“) und P21-P25-Utrikeln („P23“) sowie Utrikeln desselben Alters (Tabelle 1). ). Bündelproben werden als „BUN“ bezeichnet. sie sind leicht durch Zellkörper kontaminiert. Utrikelproben werden als „UTR“ bezeichnet; Sie enthalten auch Haarbündel, allerdings mit <1 % des Gesamtproteins (ergänzende Abbildung 1). Für jede der vier Bedingungen wurden vier biologische Replikate hergestellt. Die Proteine ​​wurden teilweise durch SDS-PAGE aufgetrennt und dann in Peptide verdaut. LC-MS/MS wurde verwendet, um Peptide aus den vier Bedingungen zu identifizieren und zu quantifizieren. Wir verwendeten MaxQuant8 mit seiner integrierten Andromeda-Suchmaschine11, um Peptide mit Mausprotein-Datenbankeinträgen abzugleichen, Peptide zu Proteinen zusammenzusetzen und diese Proteine ​​zu quantifizieren. Der Arbeitsablauf für die Bündelisolierung, Probenvorbereitung, Massenspektrometrie und Datenanalyse ist in Abb. 1c dargestellt. Informationen zu den Geräteeinstellungen des Massenspektrometers, zur Datenbanksuche, zur Peptid-zu-Protein-Kartierung und zur Quantifizierung (die die Mindestanforderungen an Informationen zu einem Proteomics-Experiment [MIAPE] erfüllen12) sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Haarbündel wurden mit der Twist-off-Methode gereinigt2,4,10,13,14; Die Methoden werden ausführlich in Lit. beschrieben. 14. Utrikelmakulae wurden von CD-1-Mäusen bei P4-P6 (sich entwickelnder Utrikel) oder P21-P25 (junger Erwachsener) präpariert. Methoden zur Präparation von Maus-Utrikeln wurden an anderer Stelle vorgestellt15,16. Makulae wurden am unbehandelten Boden einer 35-mm-Kunststoffschale (EASY GRIP Falcon Petrischalen; Becton Dickinson) in Leibovitz's L-15-Medium ohne Phenolrot (21083-027; Thermo Life Technologies) befestigt. Otolithische Membranen wurden mit einer Wimper entfernt. Eine Plastikscheibe wurde um die Makulae auf der Schale gelegt und das Präparat mit 4,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (filtriert durch einen 5-μm-Filter) bei 42 °C überflutet. Man ließ die Agarose bei 4 °C zu einem festen Gel aushärten, dann wurde die durch den Ring gebildete Agarosescheibe unter einem Präpariermikroskop auf eine Perfusionsplattform gelegt. Unter ständigem Fluss mit L15 wurden die Makulae entfernt, wobei Haarbündel in der Agarose stecken blieben. Ein kleines Skalpell oder eine Wolframnadel wurde verwendet, um offensichtliche Zelltrümmer zu entfernen (Abb. 1b), dann wurden Bündel aus einem einzelnen Utrikel in einem Agarosepfropfen mit minimalem Volumen (<0,5 μl) entfernt. Isolierte Bündel in Agarose wurden bei –80 °C in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung eingefroren. Gebündelte Proben wurden später für die massenspektrometrische Analyse gepoolt.

Zur Analyse der gesamten Utrikularmakula wurde der Utrikel präpariert, um sämtliches Gewebe außerhalb des sensorischen Epithelbereichs zu entfernen, und die Otolithenmembran wurde entfernt. Im Gegensatz zu unseren vorherigen Analysen von Hühner-Utrikeln2,17, bei denen wir das sensorische Epithel von der Basalmembran und dem Bindegewebe abgezogen haben, haben wir hier ganze, ungeschälte Utrikel von Mäusen analysiert. Das sensorische Epithel des Utrikels der Maus löst sich ohne eine Proteasebehandlung (z. B. Kollagenase oder Thermolysin) nicht leicht vom Stroma. Zusätzlich zu Haarzell- und Stützzellproteinen enthielt das Präparat somit Proteine, die aus der extrazellulären Matrix, dem Stroma und den Nerven stammen.

Um isolierte Haarbündel mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen, wurde die Agarosescheibe mit den gereinigten isolierten Haarbündeln in L15-Medium in einer Platte mit 12 Vertiefungen gewaschen. Die Agarosescheibe wurde dann in 4 % Formaldehyd in PBS überführt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Scheiben über Nacht bei 4 °C gelagert. Am nächsten Tag wurden die Bündel mit 0,5 % Triton ) in PBS für 2–3 Stunden. Die Scheiben wurden dreimal in PBS gespült, dann wurden Bündel in Agarose in einer dünnen Platte von der Scheibe entfernt. Nach dem Auflegen auf einen Objektträger wurde die Probe mit VECTASHIELD-Eindeckmedium (Vector Laboratories) beschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt.

Zur Immunoblot-Charakterisierung wurden Mäusehaarbündel und Utrikeln von P21–25-Mäusen gesammelt, wie für die Massenspektrometrieexperimente beschrieben. Bündel- und Utrikelproteine ​​wurden mit reduzierendem NuPAGE LDS-Probenpuffer (Invitrogen) solubilisiert; Die Proben wurden 15 Minuten lang auf 65 °C, dann 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und durch Einlaufen in ein NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Gel (1,5 mm × 10 Vertiefungen; Invitrogen) getrennt. Die Proteine ​​wurden nach Standardverfahren auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen. Die Membran wurde mit Wasser und PBS/0,1 % Tween-20 (PBST) gespült und dann 30 Minuten lang mit schwarzer Tusche (Windsor & Newton), 1:5.000 in PBST verdünnt, gefärbt. Die Membran wurde dann 1 Stunde lang in Amersham ECL Prime Blocking Reagens (GE Healthcare) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern der Developmental Studies Hybridoma Bank (Anti-Vimentin, #AMF-17b; ATPase, Anti-Na(+) inkubiert ) K(+) Alpha-Untereinheit, #a5) 1:1.000 in Blockierungsreagenz verdünnt. Nach 5×6-minütigem Waschen in PBST wurde die Membran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Sekundärantikörpern (Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP und Ziegen-Anti-Maus-HRP), 1:10.000 in Blockierungsreagenz verdünnt, inkubiert. Die Banden wurden mit dem SuperSignal Pico West ECL-Reagenz (Thermo Scientific) sichtbar gemacht.

Um störende Polymere aus der für die Bündelisolierung verwendeten Agarose zu entfernen, trennten wir die Proteine ​​durch einen kurzen SDS-PAGE-Lauf vor der Reduktion, Alkylierung und dem Trypsinverdau2,18. Utrikelproteine ​​wurden auch durch SDS-PAGE aufgetrennt. Zur Probenvorbereitung wurde 1,2x NuPAGE LDS-Probenpuffer (Invitrogen) mit 50 mM Dithiothreitol zu einem kombinierten Endvolumen von 40–60 μl pro Bündel im Wert von 100 Utrikeln hinzugefügt; Das Volumen variierte von Probe zu Probe, je nachdem, mit wie viel Agarose die Bündel herausgeschnitten wurden. Utrikelproteine ​​wurden auch mit NuPAGE LDS-Probenpuffer (40 μl pro 10 Utrikel) solubilisiert. Die Proben wurden 15 Minuten lang auf 65 °C und dann 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Die Proteine ​​wurden aufgetrennt, indem man etwa 1 cm in ein NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Gel laufen ließ (1,5 mm × 10 Vertiefungen; Invitrogen); Eine Spur wurde für Proben von <50 μl und zwei Spuren für Proben von >50 μl verwendet. Die Gele wurden mit Wasser gespült und dann 5 Stunden lang mit Imperial Protein Stain bei Raumtemperatur (Thermo Scientific) gefärbt. Nach 5-stündigem Spülen mit Wasser bei 4 °C wurde 1 cm Gel mit getrennten Proteinen manuell in sechs Stücke geschnitten, die in den nachfolgenden Schritten jeweils separat verarbeitet wurden.

Gelstücke wurden in silikonisierte Röhrchen überführt und dann mit 200 μl Wasser in HPLC-Qualität (30 s lang gevortext), 200 μl 50 % 50 mM NH4HCO3/50 % MeOH (1 Minute lang gevortext) und 200 μl 50 % 50 mM NH4HCO3 gewaschen /50 % Acetonitril (5 Minuten lang gevortext) und 200 μl 100 % Acetonitril (30 Sekunden lang gevortext). Die restliche Lösung wurde entfernt und die Gelstücke kurz in einem SpeedVac-Vakuumkonzentrator getrocknet; Sie wurden über Nacht bei –20 °C gelagert.

Die Gelstücke wurden mit 100 μl frisch hergestelltem 25 mM DTT in 50 mM NH4HCO3 rehydratisiert und dann 20 Minuten lang bei 56 °C inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und 100 μl 55 mM Iodacetamid in 50 mM NH4HCO3 hinzugefügt; Diese Lösung wurde mit den Gelstücken im Dunkeln für 20 Minuten bei RT inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und die Gelstücke wurden zweimal mit 400 μl Wasser in HPLC-Qualität gewaschen. Die Waschflüssigkeiten wurden verworfen und 200 μl 50 % 50 mM NH4HCO3/50 % Acetonitril wurden zugegeben (5 Minuten lang gevortext). Diese Waschlösung wurde verworfen und 200 μl 100 % Acetonitril wurden zugegeben (1 Minute lang gevortext). Der Überstand wurde verworfen und die Proben 2–3 Minuten im SpeedVac getrocknet.

Wir fanden heraus, dass die Verdauung in ProteaseMAX Surfactant-Trypsin Enhancer (Promega) die Gewinnung von Haarbündelpeptiden erheblich steigerte. Eine 1 %ige Lösung von ProteaseMAX wurde durch Zugabe von 100 μl 50 mM NH4HCO3 zum Stammaliquot unter Rühren zum Mischen hergestellt; Diese ProteaseMAX-Lösung wurde auf Eis aufbewahrt. Ein 1,5-ml-Aliquot von 0,01 % ProteaseMAX wurde durch Zugabe von 15 μl 1 % ProteaseMAX zu 1485 μl 50 mM NH4HCO3 hergestellt. Ein 1,5-ml-Aliquot von 0,01 % ProteaseMAX/6 ng μl-1 Trypsin wurde durch Zugabe von 15 μl 1 % ProteaseMAX zu 1440 μl 50 mM NH4HCO3 hergestellt; Die Lösung wurde gemischt, dann wurden 45 μl einer 200 ng μl-1 Trypsin-Stammlösung (Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade, aus Schweinepankreas, dimethyliert), frisch verdünnt in 50 mM NH4HCO3, zugegeben. Zu jedem Gelstück wurden 30 μl der 0,01 % ProteaseMAX/6 ng μl−1 Trypsinlösung hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Gelstücke wurden mit 20 μl der 0,01 %igen ProteaseMAX-Lösung überschichtet, um sie vollständig untergetaucht zu halten. Der Trypsinverdau konnte 3 Stunden lang bei 37 °C erfolgen.

Die Verdaulösung wurde in neue Röhrchen überführt (25–40 μl Flüssigkeit aus jedem Röhrchen) und die Proben wurden kombiniert, wenn die ursprünglichen Gelstücke geteilt worden waren; 30 μl 2,5 % Trifluoressigsäure (in Wasser in HPLC-Qualität) wurden zu den Gelstücken gegeben (15 Minuten lang gevortext). Die Lösung wurde entfernt und mit der anfänglichen Verdauungslösung kombiniert. Die Lösung wurde verwirbelt und dann wurde die kombinierte Lösung 10 Minuten lang bei 14.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde in 0,45 μm-Filterröhrchen (Millipore Ultrafree Zentrifugalfilter, #UFC0HV00) überführt; Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 4.000 U/min geschleudert. Alle Proben wurden im SpeedVac getrocknet, bis praktisch die gesamte Lösung verdampft war (~2 Stunden), und dann vor der Massenspektrometrie bei –80 °C gelagert.

Die Haarbündel oder der Utrikel eines einzelnen Experiments wurden mithilfe von sechs LC-MS/MS-Läufen analysiert, die den sechs Gelstücken entsprachen. Das LC-MS/MS-System bestand aus einem Thermo Electron Orbitrap Velos ETD-Massenspektrometer und einer Protana-Nanospray-Ionenquelle, die mit einer Umkehrphasen-Kapillarsäule mit 8 cm Länge und 75 μm Innendurchmesser verbunden war, die mit Phenomenex C18 selbstgepackt war Jupiter mit einer Partikelgröße von 10 μm. Die Proben wurden mit 15 μl 50 % Acetonitril/5 % Ameisensäure versetzt; 7,5 μl wurden injiziert und die Peptide wurden mit einem Acetonitril/0,1 M Essigsäure-Gradienten bei einer Flussrate von 0,5 μl/min über 1,2 Stunden von der Säule eluiert. Die Nanospray-Ionenquelle wurde bei 2,5 kV betrieben. Der Verdau wurde mithilfe der datenabhängigen Fähigkeit des Instruments analysiert, wobei in aufeinanderfolgenden Scans (1) ein einzelnes vollständiges Scan-Massenspektrum im Orbitrap-Detektor mit einer Auflösung von 60.000 erfasst wurde, um Peptid-m/z und -Intensitäten zu bestimmen, und (2) 20 Produkt- Ionenspektren in der Ionenfalle, die es uns ermöglichen, Peptide mit der Datenbank abzugleichen.

Zur Proteinidentifizierung und -quantifizierung wurde die Software MaxQuant Version 1.5.1.2 verwendet8. Die mit dem MaxQuant-Download verknüpfte Standarddatei für Verunreinigungen wurde bearbeitet, um Einträge zu entfernen, von denen bekannt ist, dass sie in Haarbündeln vorhanden sind (z. B. Aktin), und um zusätzliche Verunreinigungen hinzuzufügen, die in den Arbeitsablauf zur Bündelreinigung gelangten (z. B. Keratine, Hämoglobine). Massenspektrometriedaten wurden mit Andromeda11 anhand der Ensembl-Version GRCm38_71 (veröffentlicht im April 2013) durchsucht; Die Ensembl-FASTA-Datei wurde mit kürzlich ermittelten alternativen Xirp2-Spleißprodukten19 ergänzt. „Übereinstimmung zwischen Läufen“ wurde nicht verwendet. Proteinidentifizierungen wurden mit einer Falscherkennungsrate (FDR) von 1 % gemeldet.

Wir haben MaxQuant verwendet, um iBAQ zu berechnen, ein Maß für die Proteinhäufigkeit. Der iBAQ-Wert wird durch Division der Proteinintensitäten durch die Anzahl der theoretisch beobachtbaren tryptischen Peptide zwischen 6 und 30 Aminosäuren20 ermittelt und korreliert im Durchschnitt stark mit der Proteinhäufigkeit9,20.

Wir haben ein Mathematica-Programm der Version 10 geschrieben, um die MaxQuant-Datei „proteinGroups.txt“ weiter zu verarbeiten. Dieses Programm (1) ersetzte Standard-Proteinnamen und -Symbole durch benutzerdefinierte Einträge, (2) löschte alle von MaxQuant als „Potenzielle Kontaminante“ oder „Reverse“ markierten Einträge (Proteine, die als „Nur durch Standort identifiziert“ gekennzeichnet waren, wurden beibehalten, ( 3) gruppierte Proteine, die >20 % ihrer Peptide gemeinsam haben, und (4) erstellte eine Ausgabedatei.

Die Ausgabedatei wurde in Excel importiert, wo wir (5) den relativen iBAQ (riBAQ)2,9 berechneten, der der iBAQ für ein Protein oder eine Proteingruppe (berechnet von MaxQuant) dividiert durch alle nicht kontaminierenden, nicht umgekehrten iBAQ-Werte ist Für eine Wiederholung wurden (6) Mittelwerte und Standardabweichungen für jede Versuchsbedingung bestimmt, (7) bestimmte Bündel-zu-Utrikel-Verhältnisse für jedes Entwicklungsalter berechnet und (8) P5-zu-P23-Verhältnisse für Bündel und Utrikeln berechnet .

Der benutzerdefinierte Mathematica-Code, der die MaxQuant-Ausgabe übernimmt und verwandte Proteine ​​gruppiert, ist im ProteomeXchange-Datensatz (PXD002167) verfügbar.

Alle unten beschriebenen Daten- und Analysedateien wurden im ProteomeXchange-Repository (Zugangsnummer PXD002167; http://www.proteomexchange.org) hinterlegt. Dieser Datensatz umfasst 96. RAW-Dateien, die LC-MS/MS-Daten aus allen vier Versuchsbedingungen (P5-Bündel, P5-Utrikel, P23-Bündel, P23-Utrikel) darstellen, dargestellt durch vier biologische Replikate, die in sechs Läufen analysiert wurden, eines für jede Gelscheibe (Daten). Zitat 1). Der Datensatz enthält außerdem „SEARCH_MAXQUANT.zip“, das alle MaxQuant-Dateien aus dem Ordner „txt“ enthält, sowie die Datei „experimentalDesignTemplate.txt“, die angibt, wie die Dateien von MaxQuant durchsucht werden sollen (Datenzitierung 1). . Die für die MaxQuant-Suche verwendete FASTA-Datei ist als „OTHER_FASTA.zip“ (Datenzitierung 1) enthalten, und die Mathematica-Programme, die Eingabedatei und die Ausgaben befinden sich zusammen als „OTHER_MATHEMATICA.zip“ (Datenzitierung 1). Schließlich ist die wichtigste Datei für Leser, die nicht an einer erneuten Analyse der Daten interessiert sind, „S1 Mouse P4-P21 data Orbitrap-MaxQuant 2015-05-29c.xls“, komprimiert im Datensatz als „OTHER_EXCEL_FINAL.zip“ (Datenzitierung 1). ; Dies ist die Excel-Datei, die die gemittelten Daten für jedes Protein unter jeder Versuchsbedingungen enthält. Diese Tabelle wird hier als Ergänzungstabelle 2 reproduziert.

Der Nutzen des Haarbündel-Datensatzes hängt von der Fähigkeit ab, in den Bündelproben vorhandene Proteine, die durch Kontamination durch Zellkörper entstanden sind, außer Acht zu lassen; Präparationen sind selten perfekt. Nach der Untersuchung jedes Präparats mit einem Präpariermikroskop und Dunkelfeldbeleuchtung kann ein Teil des beschädigten Gewebes entfernt werden; Wir können dann die schwerwiegendste und offensichtlichste Kontamination entfernen (Abb. 1d). Dennoch weisen die isolierten Bündelproben immer noch erhebliche Mengen an Proteinen aus Strukturen auf, von denen bekannt ist, dass sie in Haarbündeln nicht vorhanden sind, z. B. Kerne und Mitochondrien.

Wir beurteilen die Reinheit des Haarbündelpräparats, indem wir die relative Häufigkeit von Histone sowohl in den Haarbündeln als auch im Utrikel bestimmen (Tabelle 2); da Kernproteine ​​in Bündeln fehlen sollten. Das Verhältnis von BUN/UTR für Histone stellt den Anteil des in BUN vorhandenen Proteins dar, das ursprünglich aus den Utrikeln stammte. Mithilfe von Histoneinträgen, die in 4/4-BUN-Läufen und 4/4-UTR-Läufen erkannt wurden, stellten wir fest, dass die P5-BUN-Probe zu ~97 % aus Bündeln bestand und dass die P23-BUN-Probe zu ~84 % aus Bündeln bestand. Die Anreicherungswerte für die beiden Altersstufen (0,033 ± 0,027 und 0,16 ± 0,10) können verwendet werden, um statistisch eine signifikante Anreicherung von Proteinen in Bündeln gegenüber diesen Hintergrundwerten zu testen.

Darüber hinaus haben wir die Reinheit auch durch Immunblotting von Haarbündelproben mit Antikörpern gegen Proteine ​​beurteilt, von denen bekannt ist, dass sie in Haarbündeln fehlen (Abb. 1e). Bei Verwendung von P23-Proben lagen die Bündelsignale für Na+/K+-ATPase und Vimentin in diesen Tests unter der Nachweisgrenze. Allerdings handelte es sich dabei um andere Präparate als die massenspektrometrisch analysierten; Die Histonanalyse der P5- und P23-Massenspektrometriedaten ist für die Beurteilung der Kontamination in diesen Präparaten relevanter.

Für die vier Bedingungen wurden vier biologische Replikate verwendet (P5 BUN und UTR, P23 BUN und UTR). Boxplots, die die Verteilung der riBAQ-Werte für jede der 16 Proben zeigen, sind in Abb. 2a dargestellt. Ein Matrix-Streudiagramm mit paarweisen Vergleichen aller Proben ist in Abb. 2b dargestellt. Beachten Sie, dass die biologischen Replikatproben die höchsten Pearson-Korrelationskoeffizienten aufwiesen (Zahlen in Kästchen). In ähnlicher Weise zeigte die Hauptkomponentenanalyse, dass sich jeder der vier Probensätze deutlich voneinander unterschied (Abb. 2c, d). Über 90 % der Varianz waren auf PC1 zurückzuführen. Bündelproben zeigten die größte Trennung in PC2 und Utrikelproben in PC3. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse in Abb. 2, dass die Wiederholungen für jede Versuchsbedingung ausreichend ähnlich waren, dass sie kombiniert werden konnten.

(a) Boxplots, die die riBAQ-Werte für alle Proteine ​​in den angegebenen Proben zeigen. (b) Matrix-Streudiagramm, das paarweise Vergleiche der in jeder der beiden Proben nachgewiesenen Proteine ​​zeigt. Rote Linien, LOESS-Glättung der Daten. Die Zahlen auf der rechten/oberen Seite der Diagonale sind die Absolutwerte der Pearson-Korrelationskoeffizienten. Beachten Sie die höheren Korrelationen für biologische Replikate (farbiger Hintergrund). (c,d) Hauptkomponentenanalyse aller 16 Proben. In (c) wird PC1 (91 % der Varianz) gegen PC2 (5 % der Varianz) aufgetragen. In (d) wird PC2 gegen PC3 aufgetragen (2 % der Varianz).

Die Anzahl der in Bündeln und Epithel identifizierten Proteine ​​​​in jedem Alter ist in Abb. 3a angegeben. Die Verteilung der riBAQ-Werte für Utrikelproteine ​​war bei P5 im Vergleich zu P23 sehr ähnlich (Abb. 3b). Die Verteilung der logarithmischen P5/P23-Verhältnisse für jedes Protein lag bei etwa 0, was zeigt, dass die meisten Proteine ​​ihre Expressionsniveaus zwischen P5 und P23 kaum veränderten (Abb. 3c). Aufgrund der geringeren Anzahl identifizierter Proteine ​​​​wies die Verteilung der Bündelprotein-riBAQ-Proteine ​​​​eine verringerte Amplitude auf und schien auch eine Verschiebung hin zu häufiger vorkommenden Proteinen zu sein (Abb. 3d), was am deutlichsten zu erkennen war, wenn nur Proteine ​​bei 0,45 in Bündeln angereichert waren oder ein höheres Niveau wurden aufgezeichnet (Abb. 3e). Die meisten in Bündeln nachgewiesenen Proteine ​​waren bei P23 häufiger anzutreffen als bei P5 (Abb. 3f). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass eine geringere Anzahl reichlich vorhandener Proteine ​​die Bündelprobe bei P5 dominierte und dass das Bündelproteom während der Entwicklung komplexer wurde.

(a) Venn-Diagramm, das die Anzahl der in Bündeln und Utrikelproben identifizierten Proteine ​​oder Proteingruppen zeigt. Eine kleine Anzahl von Proteinen wurde nur gebündelt identifiziert. (b) Verteilung von log10 der durchschnittlichen Protein-riBAQ-Werte für Utrikelproben. Es wurden nur Proteine ​​einbezogen, die aus drei oder mehr Proben nachgewiesen wurden. (c) Verteilung der riBAQ-Werte für jedes Utrikelprotein bei P5 und P23. Die Anpassung ist eine einzelne Gaußsche Funktion (Spitze bei +0,2). (d) Verteilung von log10 der durchschnittlichen Proteinmoleküle pro Stereocilium-Werte für Bündelproben. Die riBAQ-Werte wurden in Moleküle pro Stereocilium umgerechnet, wobei davon ausgegangen wurde, dass riBAQ die Proteinfraktionshäufigkeit genau maß und dass Aktin in einer Menge von 400.000 Molekülen pro Stereocilium vorhanden war2,9. Es wurden nur Proteine ​​einbezogen, die aus drei oder mehr Proben nachgewiesen wurden. (e) Wie (d), außer dass nur Proteine ​​mit einer BUN/UTR-Anreicherung von 0,45 oder mehr einbezogen wurden. (f) Verteilung der riBAQ-Werte für jedes Bündelprotein bei P5 und P23. Die Anpassung ist eine einzelne Gaußsche Funktion (Spitze bei −0,6). (g) Gesamt-iBAQ-Werte als Proxy für das Gesamtprotein. Verunreinigungen und stornierte Einträge wurden zunächst entfernt. Die Utrikelproben von P5 und P23 waren ähnlich, jedoch gab es in der P23-Bündelprobe im Vergleich zu P5 ein 1,7-fach höheres iBAQ-Signal.

Wie oben erwähnt, wurden zwar in P5- und P23-Utrikeln eine ähnliche Anzahl von Proteinen identifiziert, in P5-Bündel wurden jedoch weniger als halb so viele Proteine ​​identifiziert wie in P23-Bündel (Abb. 3a). Bei P5 gibt es weniger Utrikelhaarzellen als bei P23 (Lit. 21), was sich auch im gesamten iBAQ-Signal widerspiegelt (ohne Verunreinigungen und umgekehrte Übereinstimmungen); Bei P23 gab es fast doppelt so viel iBAQ-Signal in Bündeln wie bei P5 (Abb. 3g).

Die integrierte Andromeda-Suchmaschine von MaxQuant sollte verwendet werden, um MS2-Spektren mit Datenbankpeptiden abzugleichen, und Proteine ​​werden basierend auf ihrem MS1-Intensitätsprofil quantifiziert. Für die MaxQuant-Analyse der RAW-Dateien sollten die Standardeinstellungen verwendet werden, mit der Ausnahme, dass die iBAQ-Quantifizierungsoption aktiviert werden sollte.

Wir haben ein Mathematica-Programm (Version 10.1.0.0) geschrieben, um die MaxQuant-Ausgabedatei „proteinGroups.txt“ weiter zu verarbeiten. Es werden zwei Versionen des Programms bereitgestellt; „MaxQuant 1.2.2.5 Maus 2013-12-19.nb“ ist die Version, die zur Analyse der Daten in diesem Projekt verwendet wird, während „MaxQuant 1.4.1.2 2015-02-25.nb“ für neuere Versionen von MaxQuant neu gestaltet wurde und ist robuster. Dieses Programm führt die folgenden Schritte aus:

(1) Ersetzen Sie Proteinnamen und -symbole. Eine Benutzerdatei mit Proteinbeschreibungen und Symbolen, die jedem Identifikator zugeordnet sind („Mouse abbrv table 2013-11-21.txt“), wurde verwendet, um die Informationen aus der FASTA-Datei zu ersetzen. Für Proteinsymbole verwenden wir in allen Fällen den Gennamen, ausschließlich in Großbuchstaben und nicht in Kursivschrift. Mehrdeutige Einträge wurden mithilfe der orthologen Suchfunktion in Ensembl und mit GeneCards (http://www.genecards.org) aufgelöst.

(2) Stornierte und verunreinigende Einträge löschen. Alle von MaxQuant als „Potenzieller Schadstoff“ oder „Reverse“ gekennzeichneten Einträge wurden gelöscht. Proteine ​​mit der Aufschrift „Nur nach Standort identifiziert“ wurden beibehalten.

(3) Gruppieren Sie Proteine, die >20 % ihrer Peptide gemeinsam haben. Wenn ein Satz von Peptiden für ein Protein mit dem eines anderen Proteins identisch war oder vollständig darin enthalten war, gruppiert MaxQuant diese Proteine ​​(„redundante Gruppen“); Der Eintrag mit der größten Anzahl an Peptiden wurde zur Identifizierung der redundanten Gruppe verwendet. Redundante Gruppen, die mehr als 20 % ihrer identifizierten Peptide gemeinsam hatten, wurden in unserer Analyse weiter gruppiert („Gruppen mit gemeinsam genutzten Peptiden“). Der Eintrag mit der größten damit verbundenen Intensität wurde zur Identifizierung der gemeinsamen Peptidgruppe verwendet. Diese Gruppen sind in der Datei mit der Bezeichnung „_ 5_GROUPS _LIST.txt“ aufgeführt.

(4) Bereiten Sie die Ausgabe vor. Es wurde eine neue Datei („proteinGroups 2013-12-18c_4_FINAL.txt“) generiert, die einen begrenzteren Satz an Informationen enthält.

Die Ausgabe der Mathematica-Datei wurde in Excel importiert. In der bei ProteomeXchange hinterlegten Datei sind alle für die Verarbeitung verwendeten Formeln noch intakt. Folgende Schritte wurden durchgeführt:

(5) Berechnen Sie riBAQ. Um eine relative Häufigkeit für jedes Protein in seiner Probe zu ermitteln, haben wir den iBAQ-Wert eines Proteins durch die Summe aller nicht kontaminierenden iBAQ-Werte für diese Probe dividiert, was einen relativen iBAQ (riBAQ) ergab. Wir haben gezeigt, dass riBAQ im Durchschnitt ein genaues Maß für die Proteinhäufigkeit ist9.

(6) Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für biologische Replikate. Wir haben den Mittelwert und die Standardabweichung der riBAQ-Werte berechnet, nicht anhand ihrer logarithmischen Transformationen.

(7) Berechnen Sie die BUN/UTR-Anreicherung in jedem Entwicklungsalter. Diese Anreicherungswerte ermöglichen die Sortierung von Proteinen, bei denen es sich wahrscheinlich um echte Bündelkomponenten handelt, von Proteinen, bei denen es sich um Kontaminanten handelt.

(8) Berechnen Sie die P5/P23-Anreicherung. Diese Verhältnisse ermöglichen die Identifizierung entwicklungsregulierter Proteine.

Zitierweise für diesen Artikel: Krey, JF et al. Das Proteom des Vestibularhaars der Maus bündelt sich im Laufe der Entwicklung. Wissenschaft. Daten 2:150047 doi: 10.1038/sdata.2015.47 (2015).

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 DC002368, R01 DC011034 und P30 DC005983 an PGB-G. sowie F32 DC012455 an JFK unterstützt. Zur Unterstützung wurde auch ein OCTRI-Pilotzuschuss (von CTSA Award UL1 TR000128) verwendet.

Oregon Hearing Research Center & Vollum Institute, Oregon Health & Science University, Portland, 97239, OR, USA

Jocelyn F. Krey und Peter G. Barr-Gillespie

WM Keck Biomedical Mass Spectrometry Lab, University of Virginia, Charlottesville, 22908, VA, USA

Nicholas E. Sherman und Erin D. Jeffery

Abteilung für öffentliche Gesundheit und Präventivmedizin, Oregon Health & Science University, Portland, 97239, OR, USA

Dongseok Choi

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JFK führte alle Experimente durch und redigierte das Manuskript. NES und EDJ führten Massenspektrometrie durch. DC führte eine statistische Analyse durch. PGB-G. analysierte Daten und schrieb das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Peter G. Barr-Gillespie.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krey, J., Sherman, N., Jeffery, E. et al. Das Proteom des Vestibularhaars der Maus bündelt sich im Laufe der Entwicklung. Sci Data 2, 150047 (2015). https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

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Eingegangen: 27. Mai 2015

Angenommen: 13. August 2015

Veröffentlicht: 15. September 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

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