ROR2 reguliert sich selbst

Oct 31, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4449 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Haarfollikel durchlaufen Regenerationszyklen, die von Haarfollikel-Stammzellen (HFSCs) angetrieben werden. Während die β-Catenin-abhängige kanonische Wnt-Signalübertragung umfassend untersucht und mit der HFSC-Aktivierung und Schicksalsbestimmung in Zusammenhang gebracht wurde, ist über die Funktion der β-Catenin-unabhängigen Wnt-Signalübertragung in HFSCs nur sehr wenig bekannt. In dieser Studie untersuchen wir die funktionelle Rolle von ROR2, einem Wnt-Rezeptor, in HFSCs. Durch die Analyse von Ror2-abgereicherten HFSCs entdecken wir, dass ROR2 nicht nur für die Regulierung der Wnt-aktivierten Signalübertragung, die für die HFSC-Aktivierung und Selbsterneuerung verantwortlich ist, unerlässlich ist, sondern auch für die Aufrechterhaltung einer ordnungsgemäßen ATM/ATR-abhängigen DNA-Schadensreaktion erforderlich ist ist für die langfristige Wartung von HFSCs unverzichtbar. Bei der Analyse von HFSCs, denen β-Catenin fehlt, identifizieren wir eine kompensatorische Rolle der ROR2-PKC-Signalübertragung beim Schutz von HFSCs ohne β-Catenin vor dem Verlust des Stammzellpools. Insgesamt enthüllt unsere Studie eine bisher unerkannte Rolle von ROR2 bei der Regulierung der Selbsterneuerung und -erhaltung von Stammzellen.

Bei Säugetieren spielt die Wnt-Signalübertragung eine Rolle bei der Gewebemorphogenese, der Stammzellaktivierung und der Tumorentwicklung1,2. Die Bindung sekretierter Wnt-Liganden an Rezeptoren und/oder Co-Rezeptoren löst verschiedene Signalkaskaden aus, die in β-Catenin-abhängige kanonische und β-Catenin-unabhängige nicht-kanonische Wnt-Signalwege unterteilt werden können1. Diese Wege können unabhängig voneinander oder kooperativ agieren, um verschiedene Zellfunktionen zu steuern.

Die kanonische Wnt-Signalübertragung (als Wnt/β-Catenin-Signalisierung bezeichnet) wird aktiviert, wenn ein Wnt-Ligand an Frizzled (Fzd) und LRP-5/6 bindet, was die Aktivierung von Disheveled (Dvl)-Proteinen auslöst, was zur Hemmung des Zerstörungskomplexes führt , bestehend aus Axin, Caseinkinase 1α (CK1α), adenomatöser Polyposis coli (APC) und Glykogensynthasekinase 3β (GSK3β), wodurch β-Catenin stabilisiert wird3,4. Das stabilisierte β-Catenin-Protein wandert dann in den Zellkern, wo es an Proteine ​​des Lymphoid-enhancing-Faktors/T-Zell-Faktors (LEF/TCF) bindet, um die Zielgenexpression zu aktivieren5. Im Gegensatz zur Wnt/β-Catenin-Signalübertragung umfassen β-Catenin-unabhängige Wnt-Signalwege mehrere intrazelluläre Signalkaskaden, die möglicherweise miteinander verbunden sind. Die Induktion nicht-kanonischer Wnt-Signale kann die Freisetzung von intrazellulärem Kalzium auslösen, das wiederum nachgeschaltete Proteinkinasen wie die Kalzium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) und die Proteinkinase C (PKC) aktiviert6,7,8. Nicht-kanonische Wnt-Signale können auch über die Rho-Familie der kleinen GTPasen übertragen werden, die die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) und den nachgeschalteten aktivierenden Protein-1-Komplex (AP-1) für die Transkriptionsregulation aktivieren oder das Zytoskelett direkt modulieren Organisation, die planare Zellpolarität (PCP) und Zellmigration orchestriert9,10,11,12,13.

Der Rezeptor-Tyrosinkinase-ähnliche Orphan-Rezeptor 2 (ROR2) wurde ursprünglich zusammen mit ROR1 als Tyrosinkinase der Trk-Familie identifiziert14 und dann aufgrund seiner Fähigkeit, mit nicht-kanonischen Wnts zu interagieren, als einer der Wnt-(Co-)Rezeptoren erkannt. einschließlich Wnt4, Wnt5a und Wnt1115,16. Genetische Studien zeigen, dass Ror2-/-Mäuse bemerkenswerte Ähnlichkeiten mit Wnt5a-/-Mäusen aufwiesen, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise im gleichen Signalweg funktionieren10,17. Bei Wirbeltieren ist ROR2 für die Wnt5a-induzierte Zellmigration erforderlich, eine Funktion, die die Aktivierung von JNK, PKC, dem Aktin-bindenden Protein Filamin A und der Rho-Familie der GTPase17,18,19,20,21 umfasst. Die Wechselwirkung von Wnt-ROR2 führt zur Phosphorylierung von Dvl, was die Aktivierung von AP-1 und Rac122,23 induziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ROR2 mit CK1 und GSK3 interagiert und von diesen phosphoryliert wird, beides Kinasen, die auch eine wichtige Rolle bei der Wnt/β-Catenin-Signalisierung spielen20,24,25,26. In mehreren Systemen wurde gezeigt, dass Wnt5a die durch β-Catenin vermittelte kanonische Wnt-Signalisierung hemmt27,28,29. Die Art, durch die ROR2 den Wnt5a-abhängigen Antagonismus der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung vermittelt, bleibt umstritten. Unter bestimmten Umständen hemmt Wnt5a die Wnt3a-induzierte β-Catenin-Signalübertragung über ROR222,30,31,32,33; in anderen ist ROR2 für diese Hemmung nicht erforderlich10,26,34. Im Gegensatz dazu wurde auch berichtet, dass ROR2 die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung verstärkt. In Osteosarkomzellen verstärkt ROR2 die Transkriptionsreaktion auf Wnt135; In Lungenkarzinomzellen aktiviert ROR2 als Co-Rezeptor mit Fzd231 die Wnt3a-induzierte kanonische Wnt-Signalübertragung. Eine Überexpression von ROR2 verstärkt die β-Catenin-vermittelte Transkription; Umgekehrt verringert sich ROR2 in Nierenkrebszellen, wenn es ausgeschaltet wird36. Es ist bemerkenswert, dass Studien, die die Wirkung von ROR2 auf die Wnt/β-Catenin-Signalisierung analysierten, hauptsächlich von der Proteinüberexpression und dem Reporter-Assay für die Wnt/β-Catenin-Signalisierungsaktivität abhingen. Die physiologische Wirkung von ROR2 auf Wnt-Signalaktivitäten bedarf weiterer Untersuchungen.

Alle Zellen im Körper sind DNA-Schäden ausgesetzt, die durch exogene Faktoren, einschließlich Mutagene, oder endogene Prozesse wie oxidativen Stress verursacht werden. Um die genomische Integrität aufrechtzuerhalten, die die Gewebehomöostase sicherstellt und die Entwicklung schädlicher Krankheiten wie Krebs verhindert, ist die durch DNA-Schadensreaktion (DDR) vermittelte DNA-Reparatur von entscheidender Bedeutung, insbesondere für adulte Stammzellen (SCs), da diese bestehen bleiben längere Zeiträume in erwachsenen Geweben37,38. Ataxia Teleangiectasia Mutated (ATM) und ATM- und Rad3-Related (ATR) sind DDR-Kinasen, die hauptsächlich durch genomische Schäden aktiviert werden; Die Funktionen von ATM und ATR bei der DNA-Schadensspezifität sind jedoch unterschiedlich39,40. Als Reaktion auf DNA-Schäden werden ATM und ATR aktiviert und phosphorylieren nachgeschaltete Signalproteine, wie Checkpoint-Kinase 2 (CHK2) für ATM und Checkpoint-Kinase 1 (CHK1) für ATR, wodurch Zellzyklus-Checkpoints, DNA-Reparatur oder Apoptose reguliert werden39,40 ,41. Unabhängig von der DDR können sowohl ATM als auch ATR auch durch die übermäßige Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) aktiviert werden, was durch einen unausgeglichenen oxidativen Stoffwechsel und/oder die Anhäufung nicht reparierter DNA-Schäden verursacht werden könnte42,43,44,45. Als Reaktion auf ROS induziert ATM die Aktivierung der 5′ AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK)43,46 und des Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 (NRF2)47,48, um den oxidativen Stoffwechsel zu modulieren bzw. eine antioxidative Reaktion zur Bekämpfung von ROS zu induzieren . Ein Mangel an ATM-abhängigem DDR in SCs kann zu einer beeinträchtigten Selbsterneuerung oder Apoptose führen, was die Anzahl der Stammzellen und ihre Funktionalität beeinflussen könnte49,50,51.

Haarfollikel (HF) sind ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen, die die Aktivierung und Aufrechterhaltung von Stammzellen regulieren52. Reife HFs durchlaufen Zyklen von Wachstum (Anagen), Degeneration (Katagen) und anschließender Ruhephase (Telogen)53,54. Haarfollikel-Stammzellen (HFSCs), die sich an der Ausbuchtung des ruhenden HF befinden, bleiben während der Telogenphase des Haarzyklus in Ruhe. Zu Beginn der Anagenphase vermehren sich einige der HFSCs und wandern nach unten, um das untere HF55 wieder aufzufüllen. Die Aktivierung von HFSCs wird streng durch Mikroumgebungssignale reguliert, die von ihren Nischenzellen ausgehen56,57,58,59,60,61. Zu Beginn des Anagens steuert die hochregulierte Wnt/β-Catenin-Signalübertragung die Transkriptionsregulation, die die HFSC-Aktivierung steuert62,63,64. HFSCs, denen β-Catenin fehlt, sind nicht in der Lage, sich einer Haarregeneration zu unterziehen62,63,65, aber sie können in ihrer ursprünglichen Nische gehalten werden, ohne die HFSC-Identität zu verlieren63. Es bleibt jedoch unklar, welcher Mechanismus dafür sorgt, dass der β-Catenin-Null-HFSC-Pool in einem reichhaltigen Milieu erhalten bleibt, in dem benachbarte Zellen entlang des Haarzyklus verschiedene Signalmoleküle absondern.

In dieser Studie identifizieren wir eine überraschende Rolle von ROR2 bei der Regulierung der Selbsterneuerung und -erhaltung von Stammzellen. Mithilfe eines genetischen Mausmodells haben wir gezeigt, dass die Abreicherung von Ror2 in HFSCs zu einer Verzögerung der HFSC-Aktivierung, einer Herunterregulierung der HFSC-Stammgene und schließlich zum Verlust einer HFSC-Population führte. Durch die Abreicherung von Ror2 in primär kultivierten HFSCs haben wir herausgefunden, dass ROR2 für die Aktivierung der Wnt-induzierten Signalübertragung und des ATM/ATR-abhängigen DDR essentiell ist und dadurch die Migration, Proliferation und Aufrechterhaltung von HFSC reguliert. Schließlich haben wir bei der Analyse von HFSCs, denen β-Catenin fehlt, die Notwendigkeit von ROR2 und der nachgeschalteten PKC identifiziert, um β-Catenin-Null-HFSCs vor dem Verlust des Stammzellpools und einer falschen Schicksalsdifferenzierung zu schützen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass ROR2 nicht nur die Wnt-Signalisierung reguliert, die die HFSC-Aktivierung und -Migration steuert, sondern auch als Schutzmechanismus dient, um die langfristige Aufrechterhaltung von HFSCs sicherzustellen.

Während sich HFSCs in einer Nische befinden, in der Wnt-Liganden während des gesamten Haarzyklus exprimiert werden,66 ist über die Funktion der Wnt-Signalübertragung in HFSCs abgesehen von der β-Catenin-abhängigen Regulation nur sehr wenig bekannt. Um diese ungelöste Frage zu beantworten, haben wir uns auf einen Wnt-Rezeptor, ROR2, konzentriert, der in der Lage ist, β-Catenin-abhängige und -unabhängige Wnt-Signale zu transduzieren17,18,19,20,21,31,35. Wir untersuchten zunächst die Expression von ROR2 in HFs mittels Immunfärbung der gesamten Haut. Wie gezeigt, wird ROR2 in HFSCs und benachbarten Zellen in der Ausbuchtung (Bu) ziemlich gut exprimiert, im sekundären Haarkeim (HG) jedoch relativ niedrig (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1a). Bemerkenswerterweise ist die ROR2-Expression in der Ausbuchtung bei HFs zu Beginn des Anagens höher als bei Telogen (ergänzende Abbildung 1b). Durch die Reinigung von Integrin-α6high/CD34+-HFSCs aus Maus-HFs bei Telogen (bezeichnet als ruhendes HFSC; qHFSC) und Anagenbeginn (bezeichnet als aktiviertes HFSC; aHFSCs) mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) konnten wir bestätigen, dass der ROR2-Proteinspiegel erhöht war aHFSCs im Vergleich zu qHFSCs (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1c). Um festzustellen, ob das hochregulierte ROR2 für die HFSC-Aktivierung funktionell von Bedeutung ist, haben wir K15CrePGR; fl) und ein Cre-aktivierter YFP-Reporter (ROSA26LSL-YFP) und dann das Ror2-Gen in HFSCs und ihren Nachkommen an den postnatalen (P) Tagen 18–25 abgereichert (Abb. 1c). Wir beobachteten, dass die ROR2-Expression in FACS-gereinigten Ror2-Conditional-Knockout-HFSCs (Ror2-cKO) beeinträchtigt war (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1d) und dass die Ausbuchtung von Ror2-cKO-HFs abnahm, während ROR1 einigermaßen exprimiert blieb (ergänzende Abb. 1e). Durch die Analyse des Haarzyklusverlaufs stellten wir fest, dass Ror2-cKO-HFs im Vergleich zu Kontroll-HFs ​​(Ror2 Ctrl) eine Verzögerung beim Anageneintritt aufwiesen (Abb. 1e). Die Verzögerung des Anageneintritts wurde im folgenden Haarzyklus zu Beginn des Anagens kontinuierlich festgestellt, was durch den verzögerten Anageneintritt des Ror2-cKO-HF und die Erholung des Haarkleides des Ror2-cKO-Tieres belegt wurde (ergänzende Abbildung 1f). Um zu klären, ob die Verzögerung des Anageneintritts in Ror2-cKO-HFs durch einen Defekt in der HFSC-Aktivierung verursacht wurde, führten wir zu Beginn des Anagens eine 24-Stunden-Verabreichung von EdU an Mäuse durch. Die Immunfärbung von Ror2 Ctrl- und cKO-Haut für CD34 und EdU zeigte einen signifikanten Rückgang der EdU+-proliferativen HFSCs in der YFP+-Ausbuchtung von Ror2-cKO-HFs (Abb. 1f), was darauf hindeutet, dass Ror2-cKO-HFSCs eine verringerte Zellproliferation aufwiesen.

a Whole-mount-Immunfluoreszenzfärbung von Maus-HFs bei Anagenbeginn und Telogen für ROR2 (rot) und CD34 (grün). Bu, Ausbuchtung; HG, Haarkeim. b Die ROR2-Expression ist in aktivierten HFSCs hochreguliert. Immunblotting-Analysen von FACS-gereinigten HFSCs aus P55- (für ruhendes HFSC; qHFSC) und P22-23-Mausrückenhäuten (für aktiviertes HFSC; aHFSC) auf ROR2 und β-Actin. Die Quantifizierung der ROR2-Proteinspiegel aus unabhängigen Experimenten ist in der folgenden Grafik dargestellt. Die Daten wurden auf β-Actin normalisiert. Die Werte wurden durch Vergleich mit qHFSC berechnet und als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. n = 4 Blots von unabhängigen FACS-sortierten HFSCs; *p = 0,0117. c Schematische Darstellung, die den verzögerten Eintritt in den Haarzyklus bei Ror2-cKO-Mäusen im Vergleich zu ihren Ctrl-Wurfgeschwistern veranschaulicht. Mäuse wurden mit RU486 behandelt, um die Cre-Rekombinase in HFSCs bei P18–25 zu aktivieren. M-Morphogenese, Tel-Telogen, Ana-Anagen, Katzenkatagen, M-Männchen, F-Weibchen. d Echtzeit-PCR-Analysen mit FACS-gereinigten Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs aus Anagenbeginn (Ana) und spätem Telogen (Late Tel). Die Werte wurden auf Ror2 Ctrl HFSC-mRNA normalisiert. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 5 (Ana) oder 4 (Late Tel) biologisch unabhängige Tiere; **p < 0,005. e H- und E-Färbung der Ror2 Ctrl- und cKO-Mausrückenhäute an den angegebenen postnatalen (P) Tagen (oben). Quantifizierung des prozentualen Anteils an HFs in den angegebenen Haarzyklusstadien, die eine Verzögerung des Anageneintritts von Ror2-cKO-HFs zeigen (unten). f Ror2 cKO HFSCs zeigen eine Verzögerung der Aktivierung beim Einsetzen der Anagenbildung. Nach 24-stündiger EdU-Markierung wurden weibliche P32-Häute immungefärbt (links) und quantifiziert (rechts). Mx, Matrix. Die Daten werden als Median (die Linie innerhalb der Box), als 25. bis 75. Perzentil (untere und obere Linie der Box) und als 10. bis 90. Perzentil (untere und obere Whiskers) angegeben. n = 7 (Strg) oder 4 (cKO) HFs, die über ein Tierpaar untersucht wurden; **p = 0,0031. Alle p-Werte wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests berechnet. Maßstabsbalken in a, e, f repräsentieren 50 μm. Alle Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Rolle von ROR2 bei der HFSC-Aktivierung weiter zu verifizieren, analysierten wir auch die Auswirkung der Ror2-Depletion in HFSCs, die durch Haarenthaarung in der 2. Telogenphase synchronisiert und aktiviert wurden (ergänzende Abbildung 2a). Histologische Analysen und EdU-Markierungsexperimente mit enthaarter Ror2 Ctrl- und cKO-Haut zeigten eine Verzögerung der enthaarungsinduzierten HFSC-Aktivierung und des Anageneintritts in Ror2 cKO-Haut (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2b), was mit dem übereinstimmt, was wir im Haar gefunden haben Radfahren während der Homöostase (Abb. 1e, f). Der HFSC-Proliferationsdefekt konnte in FACS-gereinigten HFSCs aus Ror2 Ctrl- und cKO-HFs zu Anagenbeginn rekapituliert werden. Insbesondere wenn primäre HFSCs mit Fibroblasten-Feeder-Zellen in dem Medium kultiviert wurden, das die HFSC-Proliferation fördert, zeigten Ror2-cKO-HFSCs eine geringere Koloniezahl als die Ctrl-HFSCs (Abb. 2b), was auf eine beeinträchtigte Proliferationsfähigkeit von Ror2-cKO-HFSCs hinweist. Angesichts der Tatsache, dass die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung für die HFSC-Aktivierung wesentlich ist und dass überexprimiertes ROR2 in der Lage ist, kanonische Wnt-Signalisierung in den kultivierten Zellen zu transduzieren31,35, könnte die verzögerte Aktivierung von Ror2-cKO-HFSCs teilweise durch die Beeinträchtigung der β-Catenin-Signalübertragung verursacht werden. abhängige Wnt-Signalaktivität. Um dieser Möglichkeit Rechnung zu tragen, untersuchten wir die Expression von Wnt/β-Catenin-Zielgenen63 in FACS-gereinigten Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs aus Haut 3 Tage nach der Enthaarung (3dpd), indem wir eine quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-qPCR)-Analyse durchführten. Wie in Abb. 2c gezeigt, war die Expression von Genen, die auf β-Catenin-abhängige Wnt-Signale reagieren, in enthaarungsaktivierten Ror2-cKO-HFSCs signifikant herunterreguliert. Diese Herunterregulierung wurde auch in Ror2-cKO-HFSCs zu Beginn des Anagens während des Haarzyklus festgestellt (Abb. 2d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signals, das die HFSC-Proliferation und das Fortschreiten des Anagens erleichtert, von ROR2 abhängt und die Verringerung der kanonischen Wnt-Signalaktivität bei Ror2-Depletion zu einer Verzögerung der HFSC-Aktivierung führt.

a Depilationsaktivierte Ror2-cKO-HFSCs zeigen eine Verzögerung bei der Aktivierung. Zwei Tage nach der Enthaarung und 24 Stunden nach der EdU-Markierung wurden enthaarte Häute immungefärbt (links) und quantifiziert (rechts). Die Daten werden als Median (die Linie innerhalb der Box), als 25. bis 75. Perzentil (untere und obere Linie der Box) und als 10. bis 90. Perzentil (untere und obere Whiskers) angegeben. n = 8 (Strg) oder 10 (cKO) HFs, die über ein Tierpaar untersucht wurden; ***p < 0,0001. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. b Koloniebildungseffizienz (CFE) von Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs aus Anagen-Onset-Back-Skins. Kolonien aus FACS-gereinigten HFSCs werden mit Rhodamin B gefärbt (links). Quantifizierung von CFE (rechts). Anzahl der Kolonien mit einer Größe ≥ 3 mm2 wurde gezählt. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 unabhängige Brunnen; *p = 0,0269. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. c, d Echtzeit-PCR-Analyse für Wnt/β-Catenin-Zielgene mit FACS-gereinigten Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs 3 Tage nach der Enthaarung (c) oder bei Anagenbeginn (d). Die Werte wurden auf Ror2 Ctrl HFSC-mRNA normalisiert. e, f Echtzeit-PCR-Analyse für HFSC-Stammheitsgene mit FACS-gereinigten Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs 3 Tage nach der Enthaarung (e) oder im späten Telogen (f). Daten in c–f werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 4 biologisch unabhängige Tiere; *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. g FACS-Analyse für YFP+-Zellen in der Integrin-α6high/CD34+-HFSC-Population aus Ror2 Ctrl- und cKO-HFs vor der Enthaarung (links) und 3 Wochen nach der Enthaarung (Mitte). Das Punktdiagramm (rechts) zeigt den Prozentsatz der wiederhergestellten YFP+ HFSCs 3 Wochen nach der Enthaarung. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben; n = 4 biologisch unabhängige Tiere; *p = 0,0365. h FACS-Analyse für YFP+-Zellen in der Integrin-α6high/CD34+-HFSC-Population aus Ror2 Ctrl- und cKO-HFs am 2. Telogen. Das gepaarte Punktdiagramm zeigt verringerte Prozentsätze von YFP+-HFSCs in Ror2-cKO-HFs im Vergleich zu Ror2-Ctrl-HFs. n = 10 unabhängige Wurfgeschwisterpaare; ***p = 0,0003. Alle p-Werte wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests berechnet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zusätzlich zu den Wnt/β-Catenin-Zielgenen fanden wir auch, dass durch Enthaarung aktivierte Ror2-cKO-HFSCs eine signifikante Herunterregulierung eines breiten Satzes von HFSC-Stammgenen im Vergleich zu ihren Ctrl-HFSCs zeigten (Abb. 2e). Die Herunterregulierung dieser Gene wurde auch in Ror2-cKO-HFSCs im späten 2. Telogen festgestellt, als HFSCs für die Aktivierung vorbereitet wurden (Abb. 2f). Diese Ergebnisse führten uns zu der Annahme, dass ROR2 möglicherweise auch für die Aufrechterhaltung des HFSC-Pools während der HF-Regeneration erforderlich ist. Um diese Hypothese zu testen, haben wir das Haarkleid von Mäusen enthaart und dann mithilfe von FACS den Prozentsatz der YFP+-Zellen in der Integrin-α6high/CD34+-HFSC-Population vor der Enthaarung und 3 Wochen nach der Enthaarung gemessen, als neu gebildete HFs zum Telogen zurückkehrten. Wie in Abb. 2g gezeigt, blieben YFP+ Ror2 Ctrl HFSCs nach Abschluss der HF-Regeneration vollständig in der Stammzellnische erhalten, aber nur ~82 % der YFP+ HFSCs wurden aus dem vorherigen Ror2 cKO HFSC-Pool wiederhergestellt, was darauf hindeutet, dass dies bei einigen Ror2 cKO HFSCs der Fall war geht bei der HF-Regeneration verloren. Ein ähnliches Phänomen wurde bei Ror2-cKO-HFSCs während des Haarzyklus festgestellt. Durch die Untersuchung des Prozentsatzes von YFP+-Zellen in der α6high/CD34+-HFSC-Population von Ror2 Ctrl- und cKO-HFs in der 2. Telogenphase stellten wir fest, dass Ror2-cKO-HFs einen geringeren Prozentsatz an YFP+-Zellen in ihren HFSC-Pools aufwiesen als die gepaarten Ror2 Ctrl-HFs ​​(Abb. 2h), was darauf hinweist, dass einige Ror2-cKO-HFSCs nach dem Haarzyklus nicht wiederhergestellt wurden. Wir stellten jedoch fest, dass Ror2-cKO-HFSCs, wenn sie die erste Enthaarung überleben konnten, die nachfolgende HF-Regeneration bei wiederholter Enthaarung aufrechterhalten konnten (ergänzende Abbildung 3a). Dies könnte erklären, warum YFP + Ror2 cKO-HFSCs in einigen gealterten HFs einigermaßen erhalten bleiben konnten (ergänzende Abbildung 3b). Dieses Ergebnis legt nahe, dass der Verlust von ROR2 durch andere Faktoren in den wiederhergestellten Ror2-cKO-HFSCs ausgeglichen werden könnte.

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass ROR2 für die HFSC-Aktivierung über die Regulierung der Wnt/β-Catenin-Signalaktivität und auch für die Aufrechterhaltung einer HFSC-Population in vivo erforderlich ist.

Da wir feststellten, dass der HFSC-Pool in Ror2-cKO-HFs während der HF-Regeneration reduziert wurde, bewerteten wir die Kapazität der HFSC-Aufrechterhaltung, indem wir Koloniebildungstests durchführten und anschließend eine Langzeitkultur mit FACS-gereinigten HFSCs aus Ror2 Ctrl und cKO-HFs bei Telogen durchführten. Wir fanden heraus, dass Telogen-Ror2-cKO-HFSCs auch verringerte Koloniezahlen im Kulturmedium aufwiesen, was die Proliferation förderte (Abb. 3a), was auf einen Defekt in der Fähigkeit zur Selbsterneuerung hinweist. Wenn einzelne HFSC-Kolonien, die auf einer Feeder-Schicht wuchsen, ausgewählt und seriell in Kultur passagiert wurden, konnten Ror2-cKO-HFSCs nicht langfristig aufrechterhalten werden (Abb. 3b). Darüber hinaus verloren Ror2-cKO-HFSCs nach der Entfernung aus Feederzellen ihre Fähigkeit zur Proliferation und zeigten eine differenzierte Morphologie (Abb. 3c). Diese differenzierungsähnlichen Ror2-cKO-HFSCs exprimierten nicht nur niedrigeres Cyclin D1 (kodiert durch Ccnd1), was ihrer geringeren Proliferation entspricht, sondern verloren auch die Expression der HFSC-Marker Cd34 und Krt15 (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass ROR2 für die Aufrechterhaltung unerlässlich ist HFSC-Identität. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse gereinigter HFSCs in Kultur unsere In-vivo-Studien, die zeigen, dass ROR2 eine entscheidende Rolle bei der Selbsterneuerung und Aufrechterhaltung von HFSCs spielt.

ein CFE von Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs aus Telogenphasen-Rückenhäuten. Kolonien aus FACS-gereinigten HFSCs werden mit Rhodamin B gefärbt (links). Quantifizierung von CFE (rechts). Anzahl der Kolonien mit einer Größe ≥ 3 mm2 wurde gezählt. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 unabhängige Brunnen; **p = 0,0007. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. b Ror2 cKO HFSCs konnten nicht passagiert und langfristig aufrechterhalten werden. Einzelne Ror2 Ctrl- oder cKO HFSC-Kolonien wurden isoliert, kultiviert und passagiert. Die Ror2-Depletion wurde für einzelne Kolonien überprüft. (Links) Ror2 Ctrl HFSCs konnten mit Feedern passagiert und aufrechterhalten werden, wie durch die YFP-Expression belegt, wohingegen YFP+ Ror2 cKO HFSCs während der Passage verloren gingen. Weiße gestrichelte Linien kennzeichnen die Umrisse von HFSC-Kolonien. Der Maßstabsbalken stellt 200 μm dar. (Rechts) Diagramm, das zeigt, dass Ror2-cKO-HFSCs nicht langfristig in Kultur gehalten werden konnten. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 Gruppen, 6 Kolonien pro Gruppe wurden untersucht. c Kultivierte Ror2-cKO-HFSCs weisen eine differenzierungsähnliche Morphologie und eine verringerte Proliferationsfähigkeit auf. (Links) Bilder des Differentialinterferenzkontrasts (DIC) von langfristig kultivierten Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs. (Rechts) Die Proliferationsfähigkeiten von Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs wurden anhand der täglichen Zellzahlen gemessen. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 Wells mit Einzelproben. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. d Kultivierte Ror2-cKO-HFSCs zeigen eine verringerte Expression der HFSC-Marker Cd34 und Krt15. qPCR von mRNAs (links) und Immunblotting (rechts) von höher passagierten Ror2 Ctrl- und cKO-HFSCs. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 unabhängige HFSC-Kolonien; Ror2, **p < 0,0001; Ccnd1, **p = 0,0001; Cd34, **p = 0,0075; Krt15, **p = 0,0028. Alle p-Werte wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests berechnet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da gereinigte Ror2-cKO-HFSCs nicht in Kultur gehalten werden konnten, erzeugten wir Ror2-/-HFSCs, indem wir HFSCs kultivierten, die bedingte Ror2-Allele (Ror2fl/fl) und YFP-Reporter (ROSA26LSL-YFP) trugen, und sie mit lentiviraler Cre-Rekombinase in Kultur transduzierten ( Ergänzende Abbildung 4a). Auf diese Weise konnten wir die Veränderungen der Signaltransduktion und Genexpression in HFSCs nach dem Verlust von Ror2 untersuchen. Wir haben zunächst die Effizienz der Ror2-Abreicherung in HFSCs bestätigt. Wie gezeigt, wurde die Expression des ROR2-Proteins in Cre-exprimierenden (Ror2–/–) HFSCs vollständig aufgehoben, während die Expression von ROR1 in Ror2–/– HFSCs während der Passage erhöht wurde (linkes Feld, Abb. 4a). Anschließend charakterisierten wir Ror2-/-HFSCs, indem wir ihre Reaktionen auf die Wnt-Stimulation untersuchten. Frühere Studien haben gezeigt, dass ROR2 die Wnt5a-induzierte Zellmigration über die Aktivierung von JNK, PKC und kleinen GTPasen vermittelt17,18,19,20,21. Hier untersuchten wir die Kontroll- (Ror2+/+) und Ror2−/− HFSCs auf Wnt5a-induzierte Aktivierung von JNK und PKC sowie auf die Aktivitäten von Rac1 und Cdc42. Durch die Durchführung einer Western-Blot-Analyse mit Wnt-stimulierten HFSCs zeigten wir, dass Dvl2 phosphoryliert war (verschobene obere Banden, Pfeilspitze im linken Feld von Abb. 4a) und die nachgeschalteten Effektoren JNK- und PKC-Proteine ​​​​klassischer und neuer Unterfamilien (in unserem als PKC bezeichnet) aufwiesen Studie) wurden durch Wnt5a-Stimulation in Ror2+/+ HFSCs aktiviert, diese Aktivitäten wurden jedoch in Ror2−/− HFSCs abgeschwächt (+Wnt5a, linkes Feld, Abb. 4a). Unter Verwendung eines etablierten kleinen GTPase-Aktivierungstests, der Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine ​​verwendet, die aktive Formen (GTP-gebundene Formen) von Rac1 und Cdc42 erkennen, stellten wir fest, dass die Aktivitäten von Rac1 und Cdc42 unabhängig von der Wnt5a-Stimulation in Ror2 deutlich reduziert waren −/− HFSCs (Abb. 4b). Bemerkenswert ist, dass ROR1 zwar in kultivierten Ror2-/-HFSCs hochreguliert war, diese Hochregulierung jedoch offenbar nicht ausreichte, um die durch Wnt5a-ROR2 vermittelte Signalregulierung zu kompensieren. Zusammengenommen belegen diese Daten die wesentliche Rolle von ROR2 bei der Übertragung von Wnt5a-abhängigen Signalen in HFSCs.

a Ror2+/+ und Ror2–/– HFSCs wurden 30 und 60 Minuten lang mit Wnt5a oder Wnt3a behandelt, bevor sie für das Immunoblot geerntet wurden. Die Pfeilspitze bezeichnet die phosphorylierte Form des Dvl2-Proteins. Werte der fachen Änderung der Proteingehalte werden unter den angegebenen Banden angezeigt. Die Daten wurden auf β-Actin oder α-Tubulin normalisiert und durch Vergleich mit Ror2+/+ HFSCs bei 0' berechnet. Die Quantifizierung der phosphorylierten Proteine ​​zu Gesamtproteinen im zeitlichen Verlauf ist unten dargestellt. b Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs wurden 2 Stunden lang mit Wnt5a behandelt, und GTP-gebundenes Rac1 oder Cdc42 wurden heruntergezogen und mithilfe eines kleinen GTPase-Aktivierungstests identifiziert. Die Quantifizierung des Proteingehalts wird angezeigt. Die Daten der Gesamtproteine ​​wurden auf β-Actin normalisiert. c ROR2 ist für die transkriptionelle Aktivierung der kanonischen Wnt-Signalisierung erforderlich. HFSCs wurden über Nacht ausgehungert und dann 6 Stunden lang mit Wnt3a behandelt. Die Falten der Wnt3a-Induktion wurden durch den Vergleich von mit Wnt3a behandelten HFSCs mit ihren mit Vehikel behandelten Gegenstücken berechnet. Oberhalb der Balken sind Reduktionsfalten dargestellt. Die Daten werden als Durchschnitt ± sd d angegeben. Die Hemmung der GSK3β-Aktivität stellt die Expression kanonischer Wnt-Zielgene in Ror2–/– HFSCs wieder her. Echtzeit-PCR-Analysen von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs, die 24 Stunden lang mit DMSO (Vehikel) oder CHIR-99021 (GSK3i) behandelt wurden. e Ror2–/– HFSCs reagieren nicht auf Wnt5a-induzierte Zellmigration. Die Migrationsfähigkeiten von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs wurden durch einen Transwell-Zellmigrationsassay mit Wnt5a oder Serum als Chemoattraktionsmittel untersucht. f Echtzeit-PCR-Analysen von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs für Ror2-, Ror1-, HFSC-Stamm- und HF-Schicksal-bezogene Gene. Beachten Sie, dass mit Ausnahme von Nfatc1, das mit dem Ruhezustand von HFSCs zusammenhängt, Ror2-/-HFSCs geringere Werte an HFSC-Stamm- und HF-Schicksal-bezogenen Genen exprimierten. Die Daten in d–f werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 unabhängige Experimente; *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Alle p-Werte wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests berechnet. Alle Immunblotting-Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Nicht nur Wnt5a, sondern auch Wnt3a, ein kanonischer Wnt-Ligand, könnte JNK in HFSCs auf ROR2-unabhängige Weise aktivieren (+Wnt3a, linkes Feld, Abb. 4a). Interessanterweise könnte die Ror2-Depletion die Wnt3a-induzierte GSK3β-Inaktivierung und den Axin1-Abbau deutlich beeinträchtigen (+Wnt3a, rechtes Feld, Abb. 4a). Wie gezeigt, könnte sowohl die Wnt3a- als auch die Wnt5a-Stimulation die Inaktivierung von GSK3β induzieren, was durch den Anstieg der Ser-9-Phosphorylierung überwacht wird; Diese Inaktivierung wurde jedoch in Ror2-/-HFSCs aufgehoben (rechtes Feld, Abb. 4a). Bemerkenswerterweise war die insgesamt inaktive Form von GSK3β niedriger als in Kontroll-HFSCs (rechtes Feld, Abb. 4a), während die Phosphorylierung von GSK3β an Tyr-216 nicht verändert wurde (ergänzende Abb. 4b). Da GSK3β als eine konstitutiv aktive Kinase67,68 gilt, lässt eine Verringerung des Spiegels seiner inaktiven Form auf eine Erhöhung der GSK3β-Kinaseaktivität schließen. Tatsächlich wurde die erhöhte Aktivität von GSK3β in Ror2-/- HFSCs durch einen Anstieg von p-β-Catenin S33/37/T41 bestätigt (rechtes Feld, Abb. 4a). Ein Anstieg von p-LRP6S1490 ist ein weiterer Hinweis auf eine erhöhte GSK3β-Aktivität in Ror2-/-HFSCs (rechtes Feld, Abb. 4a). Im Einklang mit dieser Beobachtung entdeckten wir auch, dass Ror2-/-HFSCs im Vergleich zu Ror2+/+-HFSCs eine signifikante Verringerung der Wnt3a-induzierten Expression kanonischer Wnt-Zielgene aufwiesen (Abb. 4c). Die Hemmung der GSK3β-Aktivität durch die Behandlung von CHIR-99021 (GSK3-Inhibitor; GSK3i) erhöhte den Gesamtpool an β-Catenin (ergänzende Abbildung 4c) und stellte die Expression kanonischer Wnt-Zielgene in Ror2 -/- HFSCs wieder her (Abb. 4d). ), was weiter hervorhebt, dass die Herunterregulierung der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung in Ror2–/– HFSCs durch die freigesetzte GSK3β-Aktivität verursacht wurde, die den β-Catenin-Abbau verstärkte. Diese Ergebnisse stützen unseren In-vivo-Befund, der zeigt, dass Wnt/β-Catenin-Zielgene in aktivierten Ror2-cKO-HFSCs herunterreguliert wurden (Abb. 2c, d), und legen nahe, dass die Herunterregulierung der Wnt/β-Catenin-Signalisierung eine, aber nicht die einzige sein könnte , Ursache der verzögerten HFSC-Aktivierung.

Die Verringerung der JNK-, PKC- und kleinen GTPasen-Aktivitäten deutete darauf hin, dass Ror2-/-HFSCs möglicherweise Defekte in der Wnt5a-induzierten Zellmigration aufweisen. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, führten wir einen Transwell-Zellmigrationstest mit Ror2+/+- und Ror2-/--HFSCs durch, wobei wir entweder Wnt5a oder Serum als Chemoattraktor verwendeten. Wie in Abb. 4e gezeigt, förderte Wnt5a die Zellmigration von Ror2+/+ HFSCs erheblich, dieser Migrationseffekt wurde jedoch bei Ror2–/– HFSCs vollständig aufgehoben. Selbst nach Stimulation mit Serum, das zusätzliche Migrationsstimuli enthält, waren Ror2-/-HFSCs immer noch nicht in der Lage, effizient zu migrieren (Abb. 4e), was darauf hindeutet, dass Ror2-/-HFSCs in der Zellbewegung fehlerhaft sind. Tatsächlich zeigten Ror2-/-HFSCs bei der Untersuchung mittels Kratzwunde-Migrationsassay eine eingeschränkte Fähigkeit zur kollektiven Zellmigration (ergänzende Abbildung 4d), was auf die unersetzliche Rolle von ROR2 bei der Regulierung der HFSC-Motilität hinweist.

Darüber hinaus haben wir im Einklang mit unseren In-vivo-Befunden (Abb. 2e, f) auch festgestellt, dass kultivierte Ror2-/-HFSCs nicht in der Lage waren, die Expression von HFSC-Stammgenen aufrechtzuerhalten. Mit Ausnahme von Nfatc1, das mit der HFSC-Ruhe assoziiert ist, exprimierten Ror2-/−-HFSCs tatsächlich geringere Mengen an HFSC-Stammgenen sowie HF-Schicksalsgenen (Abb. 4f). Zusammengenommen bestätigen unsere Analysen mit kultivierten HFSCs, denen Ror2 fehlt, nicht nur die früheren Entdeckungen, dass ROR2 Wnt5-abhängige Signalübertragung und Zellmigration über die Aktivierung von JNK, PKC und kleinen GTPasen vermittelt, sondern zeigen auch, dass endogenes ROR2 erforderlich ist, um kanonisches Wnt5 aufrechtzuerhalten. induzierte die Transkriptionsaktivierung von β-Catenin über die Regulierung der GSK3β-Stabilität.

Zusätzlich zu Zellmigrationsdefekten beobachteten wir bei der Durchführung von EdU-Markierungsexperimenten auch, dass weniger Ror2–/– HFSCs eine S-Phase-DNA-Synthese durchliefen, was durch eine geringere Anzahl von Ror2–/– HFSCs belegt wurde, die EdU-Einbau zeigten (Abb. 5a). Interessanterweise zeigte die Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie eine Abnahme des Anteils von Ror2–/– HFSCs in der G0/G1-Phase und die Akkumulation von Ror2–/– HFSCs sowohl in der S- als auch in der G2/M-Phase (Abb. 5b). Die Ergebnisse der EdU-Markierung und der Zellzyklusanalyse zeigten, dass Ror2-/-HFSCs ein langsameres Fortschreiten der S-Phase und einen Stillstand des G2/M-Zellzyklus zeigten. Die Verlangsamung der DNA-Replikation ist das Kennzeichen des S-Phase-DNA-Schadenskontrollpunkts, und der Stillstand des G2/M-Zellzyklus ist ebenfalls eine Folge von DNA-Schäden69,70; Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Ror2-/-HFSCs eine DNA-Schadensreaktion auslösen. DNA-Schäden können durch exogene Faktoren oder endogene Quellen ausgelöst werden. Angesichts der gleichen Kulturbedingungen von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs waren endogene Prozesse wie oxidativer Stress wahrscheinlich die Ursache für DNA-Schäden in Ror2−/− HFSCs. Um diese Möglichkeiten anzugehen, führten wir eine Immunfärbung für γH2AX durch, einen Biomarker für DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs)71, und 8-Oxoguanin (8-oxoG), einen Biomarker zur Messung der Wirkung oxidativer DNA-Schäden72. Wie in Abb. 5c und der ergänzenden Abb. 5a gezeigt, deuteten dreimal mehr Ror2–/– HFSCs mit mehr als 6 γH2AX-Foci als Ror2+/+ HFSCs auf die Akkumulation von DNA-DSBs in Ror2–/– HFSCs hin. Wir fanden auch einen signifikanten Prozentsatz von Ror2–/– HFSCs, die eine Kernfärbung von 8-oxoG aufwiesen, etwas, das in den Kernen von Ror2+/+ HFSCs nicht nachgewiesen wurde (Abb. 5d). Die Kernfärbung von 8-oxoG in Ror2–/– HFSCs deutete auf eine Zunahme der Produktion intrazellulärer ROS hin. Anhand der Färbung mit CellROX-Farbstoff war zu erkennen, dass der ROS-Wert in Ror2-/-HFSCs tatsächlich signifikant höher war (Abb. 5e). Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Erschöpfung von Ror2 zu einer übermäßigen ROS-Produktion und einer Anhäufung von DNA-Schäden führt, was wiederum zu einer langsamen Proliferation und einem Stillstand des Zellzyklus führt.

a Ror2−/− HFSCs zeigen eine verringerte Zellproliferation. HFSCs wurden vor der Untersuchung 4 Stunden lang mit EdU markiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben; n = 5 unabhängige Experimente; ***p = 0,00001. b Ror2-Depletion führt zu einem langsameren Fortschreiten der S-Phase und einem Stillstand des Zellzyklus in der G2/M-Phase. (Links) Der DNA-Gehalt von HFSCs wurde mit DAPI gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (Rechts) Das Balkendiagramm zeigt die Zellzyklusverteilung. c Ror2−/− HFSCs zeigen einen signifikanten Anstieg an Doppelstrangbrüchen. Immunfluoreszenzfärbung von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs für γH2AX (rot). Pfeilspitzen zeigen γH2AX-Fokus. Die Quantifizierung von Zellen mit mehr als 6 Herden ist rechts dargestellt. d Immunfluoreszenzfärbung von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs für Keratin 5 (Krt5; grün) und 8-Oxoguanin (8-oxoG; rot). Die Quantifizierung der Zellen, die nukleäres 8-oxoG aufweisen, ist rechts dargestellt. e Durchflusszytometrie-Analyse des ROS-Spiegels in Ror2+/+- und Ror2−/− HFSCs mit CellROX Deep Red-Reagenz. Die Werte der fachen Änderung des ROS-Niveaus werden rechts angezeigt. f–i Immunblotting-Analysen von Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs für aktivierte und Gesamtproteine ​​von ATM und ATR (f), AMPK (h), NRF2 (i) sowie für phosphorylierte ATM/ATR-Substrate und ROR2 ( G). Vinculin, α-Tubulin und β-Actin wurden als interne Kontrollen für die angegebenen Experimente verwendet. Werte der fachen Änderung der Proteingehalte werden unter den angegebenen Banden angezeigt. j Die Hemmung der GSK3β-Aktivität stellt das Expressionsniveau und die Aktivität von NRF2, jedoch nicht von AMPK, in Ror2-/-HFSCs wieder her. Immunblotting-Analysen mit Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs, behandelt mit DMSO (Vehikel) oder CHIR-99021 (GSK3i) für 24 Stunden. Die Maßstabsbalken in c und d repräsentieren 15 bzw. 50 μm. Die Daten in b–e werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 unabhängige Experimente; **p < 0,005, ***p < 0,0005 (b), **p = 0,0035 (c), **p = 0,0024 (d), *p = 0,02 (e). Alle p-Werte wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests berechnet. Alle Immunblotting-Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

ATM und ATR sind zentrale Regulatoren des DDR, und ATM fungiert auch als Redoxsensor zur Steuerung des ROS-Spiegels. Ein ATM-Mangel erhöht den ROS-Spiegel und verringert die NRF2-abhängige antioxidative Reaktion37,42,43. Eine übermäßige ROS-Produktion und die Anhäufung von DNA-Schäden in Ror2-/-HFSCs veranlassten uns zu der Annahme, dass die Ror2-Depletion die ATM- und/oder ATR-abhängige DDR beeinträchtigen könnte. Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir die ATM-Aktivität sowie die Aktivität von ATR untersucht, das als ergänzender Regulator für ATM im DDR73 fungieren könnte. Immunblotting-Analysen zeigten eine dramatische Verringerung der Aktivität und Gesamtproteinexpression von ATM und in geringerem Maße von ATR in Ror2-/-HFSCs (Abb. 5f). Die verringerte ATM/ATR-Aktivität in Ror2-/-HFSCs wurde außerdem durch die verminderte Phosphorylierung von ATM/ATR-Substraten bestätigt, die Zellzyklus-Kontrollpunkte und DNA-Reparatur regulieren73 (Abb. 5g). Genauer gesagt wurden CHK2 und CHK1, die direkten Downstream-Ziele von ATM bzw. ATR, in Ror2-/-HFSCs herunterreguliert (ergänzende Abbildung 5b).

Aufgrund des erhöhten ROS-Spiegels könnte eine Herunterregulierung von ATM in Ror2-/-HFSCs auch die ROS-aktivierten ATM-Downstream-Effektoren AMPK und NRF2 gefährden. Tatsächlich war die Phosphorylierung von AMPK und NRF2 in Ror2-/-HFSCs im Vergleich zu ihren Kontrollzellen verringert (Abb. 5h, i). Die Herunterregulierung von NRF2 wurde weiter durch die bemerkenswerte Reduktion von aktiviertem NRF2 im Kern von Ror2-/-HFSCs demonstriert (ergänzende Abbildung 5c). Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Hemmung von NRF2 zu einer Transkriptionsrepression von ATM- und ATR-Genen führen kann; Daher könnte die dramatische Verringerung der NRF2-Aktivität erklären, warum die Gesamtproteinspiegel von ATM und ATR in Ror2-/-HFSCs deutlich beeinträchtigt waren.

GSK3β hemmt nachweislich auch die Aktivität von AMPK74 und reguliert den Abbau von NRF275; Daher könnte die freigesetzte GSK3β-Aktivität in Ror2-/-HFSCs eine der Ursachen für deren Herunterregulierung sein. Tatsächlich konnte die Hemmung der GSK3β-Aktivität durch die Behandlung mit GSK3-Inhibitor das Expressionsniveau und die Aktivität von NRF2 in Ror2–/– HFSCs auf vergleichbare Werte wie in Ror2+/+ HFSCs zurückführen, hatte jedoch keinen Einfluss auf die AMPK-Aktivität (Abb. 5j). ). Diese Daten legen nahe, dass eine übermäßige GSK3β-Aktivität, die auf den ROR2-Verlust zurückzuführen ist, teilweise zu einer unausgeglichenen oxidativen Reaktion in Ror2-/-HFSCs beigetragen hat. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse eine bisher nicht erkannte Rolle von ROR2 bei der Regulierung der ATM/ATR-abhängigen DDR in HFSCs. Ohne ROR2 sind HFSCs nicht in der Lage, DNA-Schäden richtig zu reparieren und die ROS-Produktion/das Auffangen auszugleichen, was auf Mängel bei der Aktivierung von ATM, ATR und ihrer nachgeschalteten Signalübertragung zurückzuführen ist, was schließlich zu einem langsamen Zellwachstum, einer Anhäufung von nicht reparierten DNA-Schäden und einer Erhöhung von führt ROS (Ergänzende Abbildung 5d).

Im Gegensatz zu Ror2-cKO-HFSCs bleiben β-Catenin-Null-HFSCs langfristig in ihrer Nische, obwohl sie während des HF-Zyklus nicht aktiviert werden können63. Der Mechanismus, der die Depletion von β-Catenin-Null-HFSC aus dem Stammzellpool verhindert, bleibt jedoch unklar. Unter Verwendung einer induzierbaren bedingten mutierten Mauslinie für β-Catenin (K15CrePGR;Ctnnb1fl/fl;ROSA26LSL−YFP) haben wir β-Catenin in HFSCs und ihren Nachkommen bei P18–25 abgereichert und festgestellt, dass β-Catenin cKO (β-cat KO ) HFs zeigten beim 1. Haarzyklus eine Verzögerung des Anageneintritts und blieben dann für den Rest des Lebens beim 2. Telogen, was durch die Verzögerung bzw. Unfähigkeit der Erholung des Haarkleides belegt wird (Abb. 6a). Bemerkenswerterweise behielten arretierte β-Cat-cKO-HFs intakte Ausbuchtungskompartimente bei (Abb. 6a, unten rechts), was auch in der vorherigen Studie festgestellt wurde, in der β-Catenin in HFSCs beim 2. Telogen erschöpft war63. Interessanterweise fanden wir bei der Analyse der Expression von HFSC-Stammheitsgenen in β-cat Ctrl- und cKO-HFSCs in der 2. Telogenphase einen Zusammenhang zwischen niedrigeren Expressionsniveaus von HFSC-Stammheitsgenen und der Hochregulierung der Ror2-Expression. Im frühen Telogen zeigten β-Cat-cKO-HFSCs ähnliche oder leicht erhöhte Werte an HFSC-Stammgenen; In diesen HFSCs war das Expressionsniveau der Ror2-mRNA mit denen in ihren Kontroll-HFSCs vergleichbar (Abb. 6b, oben). In den späten telogenen β-cat-cKO-HFSCs, in denen die Expression von HFSC-Stammgenen zurückging, stieg der Ror2-mRNA-Spiegel jedoch an (Abb. 6b, Mitte). Die Erhöhung der Ror2-Expression blieb in den β-cat-cKO-HFSCs gealterter Tiere erhalten (Abb. 6b, unten). Übereinstimmend wurde die erhöhte Ror2-Expression in β-Cat-cKO-HFSCs im späten Telogen und in gealterten HFs durch Immunfärbung des gesamten Mount bestätigt, was zeigt, dass die ROR2-Expression in der Ausbuchtung von β-Cat-cKO-HFs höher war als in Ctrl-HFs ​​im späten 2. Telogen ( Ergänzende Abb. 6a) sowie bei gealterten Tieren (Ergänzende Abb. 6b).

a β-cat cKO HFs bleiben dauerhaft in der Telogenphase, ohne das HFSC-Kompartiment zu verlieren. (Oben) Schematische Darstellung, die den Verlauf des Haarzyklus von β-cat Ctrl- und cKO-Mäusen veranschaulicht. (Unten links) β-Cat cKO-Mäuse zeigten eine Verzögerung bei der Erholung des Haarkleides beim 1. Anagen (P31) und blieben dann dauerhaft beim 2. Telogen, ohne in den nächsten Haarzyklus einzutreten, was daran zu erkennen ist, dass sich das Haarkleid von der rasierten Haut nicht erholt das ältere Tier (P198). (Unten rechts) Oil Red O-Färbung von Sebozyten auf Whole-Mount-Häuten von β-cat Ctrl- und cKO-Mäusen. Das Ausbuchtungskompartiment der β-Cat-cKO-HFs bei alten Tieren ist intakt und die HFSCs bleiben erhalten. b Echtzeit-PCR-Analysen von FACS-gereinigten β-cat Ctrl- und cKO-HFSCs aus frühen (P55-60), späten (P65-90) und gealterten (>P250) Telogen-HFs. Die Werte der β-cat-cKO-HFSCs wurden für jeden Satz auf β-cat-Ctrl-HFSC-mRNA normalisiert. c Ror2-Depletion in β-cat-cKO-HFs führt zum Verlust von HFSCs und zu einer falschen Schicksalsdifferenzierung. (Oben) Schematische Darstellung, die den Verlauf des Haarzyklus von Ror2/β-cat Ctrl-, Ror2 cKO-, β-cat cKO- und Ror2/β-cat dKO-Mäusen veranschaulicht. (Unten links) Oil Red O-Färbung von Sebozyten auf Whole-Mount-Häuten von Ror2/β-cat Ctrl-, Ror2 cKO-, β-cat cKO- und Ror2/β-cat dKO-Mäusen. (Unten rechts) Dargestellt ist die Quantifizierung von HFs mit normaler Struktur, vergrößerten Talgdrüsen (SGs) oder mit verminderter Ausbuchtung. d Immunfluoreszenzbilder von Whole-Mount-Häuten von Ror2/β-cat Ctrl- und dKO-Mäusen für YFP. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. e Echtzeit-PCR-Analysen von Ror2/β-cat Ctrl- und dKO-HFSCs für HFSC-Stammheitsgene. Die Werte wurden auf mRNA von Ror2/β-cat Ctrl HFSCs normalisiert. Maßstabsbalken in a, c, d repräsentieren 50 μm. Die Daten in b und e werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 4 (für Early Tel), 5 (für Late Tel) oder 3 (für Aged Tel) biologisch unabhängige Tiere (b), n = 4 biologisch unabhängige Tiere (e); *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu untersuchen, ob hochreguliertes ROR2 in β-Cat-cKO-HFSCs eine Rolle bei der HFSC-Aufrechterhaltung spielt, haben wir eine induzierbare bedingte Doppelmutanten-Mauslinie für Ror2 und β-Catenin (K15CrePGR;Ror2fl/fl;Ctnnb1fl/fl;ROSA26LSL−YFP) generiert als Ror2/β-cat dKO. Der Abbau von Ror2 und/oder β-Catenin wurde durch die Verabreichung von RU486 an Mäuse bei P18–25 eingeleitet. Ähnlich wie Ror2-cKO- und β-cat-cKO-Mäuse zeigten auch Ror2/β-cat-dKO-Mäuse eine Verzögerung des Anageneintritts im 1. Haarzyklus (Abb. 6c, oben). Zu Beginn des 2. Anagens zeigten Ror2-cKO-HFs jedoch kontinuierlich eine Verzögerung des Anageneintritts (Abb. 1e) und β-cat-cKO-HFs wurden am Telogen angehalten (Abb. 6a und ergänzende Abb. 7a), Ror2/β- Katzen-dKO-HFs konnten den Haarzyklus nicht initiieren und zeigten Anzeichen einer massiven Sebozytendifferenzierung (Abb. 6c und ergänzende Abb. 7b). Die quantitative Analyse von HFs aus Ctrl-, Ror2-cKO-, β-cat-cKO- und Ror2/β-cat-dKO-Mäusen zeigte, dass der Phänotyp mit vergrößerten Talgdrüsen (SGs) nur bei Ror2/β-cat-dKO-HFs beobachtet wurde und dass mehr als a Die Hälfte der Ror2/β-cat-dKO-HFs zeigte vergrößerte SGs, begleitet von einer abweichenden HF-Struktur oder verminderten Ausbuchtungskompartimenten (Abb. 6c, unten). Die Immunfärbung von Ganzkörper-HFs zeigte den allmählichen Verlust von CD34+ Ror2/β-cat-dKO-HFSCs zusammen mit der Vergrößerung von SG (ergänzende Abbildung 7c). Die Abstammungsverfolgung mit YFP bestätigte, dass diese differenzierten Sebozyten, die sich in vergrößerten SGs befinden, aus Cre-aktivierten YFP+ Ror2/β-cat dKO HFSCs erzeugt wurden (Abb. 6d). Die Abreicherung von Ror2 und β-Catenin wurde in FACS-gereinigten YFP+-Ror2/β-cat-dKO-HFSCs bestätigt, die eine deutliche Herunterregulierung der HFSC-Stammgene zeigten (Abb. 6e); Diese Herunterregulierung war sogar noch signifikanter als bei Ror2-cKO (Abb. 2e, f) oder bei den späten telogenen β-cat-cKO-HFSCs (Abb. 6b). Zusammenfassend enthüllen unsere Ergebnisse eine bisher nicht erkannte Rolle von ROR2 bei der langfristigen Aufrechterhaltung von HFSCs, die besonders wichtig für diejenigen HFSCs ist, die bei ihrer Aktivierung eine falsche Schicksalsdifferenzierung erfahren würden.

Wir haben gezeigt, dass ROR2 für die Wnt-induzierte Aktivierung von JNK und PKC erforderlich ist (Abb. 4a). Ohne zusätzliche Wnt-Stimulation waren die Gesamtaktivitäten von JNK und PKC in Ror2-/-HFSCs, die im regulären Wachstumsmedium eine signifikante Verringerung von p-GSK3βS9 zeigten, bereits geringer (ergänzende Abbildung 8a). Abgesehen von kultivierten HFSCs stellten wir auch fest, dass sowohl die Gesamtform als auch die aktivierten Formen von JNK- und PKC-Proteinen in durch Enthaarung aktivierten Ror2-cKO-HFSCs signifikant reduziert waren (Abb. 7a). Die Immunfärbung der gesamten Ror2 Ctrl- und cKO-Haut zu Beginn des Anagens bestätigte die Verringerung der JNK- und PKC-Proteinexpression und ihrer Aktivitäten in enthaarungsaktivierten Ror2 cKO-HFSCs (ergänzende Abbildung 8b). Bemerkenswerterweise blieb die Verringerung der PKC-Expression in Ror2-cKO-HFSCs, die eine verminderte ROR2-Expression zeigten, in der Telogenphase bestehen (Abb. 7b). Um zu untersuchen, ob die Auswirkungen der Ror2-Depletion auf die HFSC-Proliferation und -Aufrechterhaltung durch die Herunterregulierung von JNK und/oder PKC in Ror2-/-HFSCs verursacht wurden, verwendeten wir die niedermolekularen Inhibitoren SP600125 (JNK-Inhibitor; JNKi) und GF109203X (selektiver PKC-Inhibitor). zu klassischen und neuartigen PKC-Isoformen (PKCi), um die Aktivitäten von JNK bzw. PKC von kultivierten HFSCs zu unterdrücken, und untersuchten dann ihre Auswirkungen auf die HFSC-Proliferation durch die Durchführung von EdU-Markierungsexperimenten. Wie gezeigt, löschte die Hemmung von PKC, aber nicht von JNK, die Unterschiede in der Zellproliferation zwischen Ror2+/+ und Ror2–/– HFSCs aus (ergänzende Abbildung 8c), was darauf hindeutet, dass ROR2 die HFSC-Proliferation zumindest teilweise über PKC-abhängige Signale reguliert .

a Immunblotting-Analysen von FACS-gereinigten HFSCs aus 3dpd Ror2 Ctrl- und cKO-HFs. b Whole-mount-Immunfluoreszenzfärbung der späten telogenen Ror2 Ctrl- und cKO-HFs für ROR2 (rot) und PKCα (grün). Quantifizierungsanalysen der Fluoreszenzintensität für die ROR2- und PKCα-Färbung sind rechts dargestellt. Die Daten werden als Median (die Linie innerhalb der Box), als 25. bis 75. Perzentil (untere und obere Linie der Box) und als 10. bis 90. Perzentil (untere und obere Whiskers) angegeben. n = 18 (Strg) oder 20 (cKO) Regionen über 7 (Strg) oder 8 (cKO) unabhängige HFs; ***p < 0,0001. Ungepaarter zweiseitiger t-Test. c Immunblotting-Analysen für angegebene Proteine ​​mit Ror2+/+ und Ror2−/− HFSCs, die 24 Stunden lang mit DMSO (Vehikel) oder GF109203X (PKCi) behandelt wurden. d PKC-Hemmung in β-cat-cKO-HFs führt zum Verlust von HFSCs und einer falschen Schicksalsdifferenzierung. (Oben) Schematische Darstellung, die das Fortschreiten des Haarzyklus von Ror2/β-cat Ctrl-, dKO-Mäusen und β-cat cKO-Mäusen veranschaulicht, die in der 2. Telogenphase mit PKC-Inhibitor behandelt wurden. (Unten) Dargestellt sind die Oil Red O-Färbung von Sebozyten auf 1 Woche nach der Behandlung behandelten Ganzkörperhäuten (links) und die Quantifizierung von HFs (rechts). e Echtzeit-PCR-Analysen von FACS-gereinigten HFSCs aus 24 Stunden mit Aceton (Vehikel) oder GF109203X (PKCi) behandelten β-cat Ctrl- oder cKO-Mäusen. Die Werte der mit GF109203X behandelten β-cat Ctrl- und cKO-HFSCs wurden auf die mRNA der mit Vehikel behandelten β-cat Ctrl- bzw. cKO-HFSCs normalisiert. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; n = 3 biologisch unabhängige Tiere; *p < 0,05, **p < 0,005. Ungepaarter zweiseitiger t-Test. f Ein veranschaulichendes Modell, das unsere Ergebnisse dieser Studie zusammenfasst. In HFSCs wandelt ROR2 nicht nur Wnt5a-induzierte nicht-kanonische Wnt-Signale durch Aktivierung von PKC, JNK und kleinen GTPasen um, sondern moduliert auch Wnt3a-induzierte kanonische Wnt-Signale durch Steuerung der GSK3β-Stabilität. Parallel dazu spielt ROR2 auch eine Rolle bei der Regulierung des ATM/ATR-abhängigen DDR. Diese ROR2-abhängigen Regulierungen modulieren die Zellproliferation, Motilität und DNA-Reparatur, die für die langfristige Aufrechterhaltung von HFSCs unerlässlich sind. Alle Immunblotting-Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Maßstabsbalken in b, d repräsentieren 50 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es wurde gezeigt, dass PKC GSK3β76,77 phosphoryliert und inaktiviert. Wir fragen uns, ob die PKC-Hemmung den Ror2-Verlust durch Linderung der GSK3β-Inaktivierung teilweise wiederherstellen könnte. Wie gezeigt, beeinträchtigte die PKC-Hemmung, bestätigt durch eine verringerte PKC-Aktivität und einen verringerten Gesamtproteinspiegel bei PKCi-Behandlung, die GSK3β-Inaktivierung in Ror2+/+ HFSCs auf ein ähnlich niedriges Niveau wie in Ror2−/− HFSCs (Abb. 7c), was auf eine Verringerung von hindeutet Die PKC-Aktivität bei Ror2-Depletion könnte eine der Ursachen für eine erhöhte GSK3β-Aktivität sein. Interessanterweise hatte die PKC-Hemmung zwar die GSK3β-Stabilität erhöht, hatte jedoch nur geringe Auswirkungen auf die β-Catenin-Stabilität und die β-Catenin-abhängige Transkriptionsaktivität, beurteilt anhand der Phosphorylierungs-/Expressionsniveaus von β-Catenin und der kanonischen Wnt-Zielgenexpression (Abb. 7c und Ergänzung). Abb. 9a). Diese Daten deuten darauf hin, dass PKC hauptsächlich den zytoplasmatischen GSK3β-Pool in HFSCs moduliert. Darüber hinaus führte die PKC-Hemmung, die GSK3β stabilisierte, in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass GSK3β die NRF2-Aktivität in HFSCs negativ moduliert (Abb. 5j), zu einer Abnahme der NRF2-Aktivität, zeigte jedoch keine signifikanten Auswirkungen auf die AMPK-Aktivierung (ergänzende Abb. 9b). Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass der Verlust von ROR2 nicht nur die Wnt-abhängige Signalaktivierung beeinträchtigt, sondern auch zu einer Herunterregulierung von PKC führt, was zur GSK3β-Stabilisierung und NRF2-Inaktivierung beitragen und so zu einer unausgeglichenen oxidativen Reaktion führen könnte.

Wir haben gezeigt, dass die ROR2-Expression in β-Cat-cKO-HFSCs bei späten Telogen- und gealterten HFs erhöht war (ergänzende Abbildung 6); Interessanterweise konnten wir auch eine erhöhte PKC-Expression in diesen β-Cat-cKO-HFSCs von späten telogenen HFs (ergänzende Abbildung 10a) sowie bei alten Tieren (ergänzende Abbildung 10b) feststellen. Um festzustellen, ob PKC stromabwärts von ROR2 in β-Cat-cKO-HFSCs eine Rolle spielt, haben wir die PKC-Aktivität gehemmt, indem wir PKCi während des 2. Telogens auf die Rückenhaut von β-Cat-Ctrl- und cKO-Mäusen aufgetragen haben (Abb. 7d, oben). Bemerkenswerterweise hatten β-Katzen-cKO-HFSCs eine Woche nach der Anwendung von PKCi bereits eine Sebozytendifferenzierung durchlaufen, und drei Wochen nach der Behandlung verloren 77 % der β-Katzen-cKO-HFs ihre Ausbuchtungskompartimente, begleitet von vergrößerten SGs (Abb. 7d und ergänzende Abb . 10c). Der Phänotyp von β-Cat-cKO-HFs aufgrund der PKC-Hemmung wiederholte den Effekt der Ror2-Depletion in β-Cat-cKO-HFSCs, was darauf hindeutet, dass PKC bei der Regulierung der HFSC-Erhaltung in derselben Achse wie ROR2 wirkt. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Wirkung der PKC-Hemmung bei der Herunterregulierung von HFSC-Stammgenen bei β-cat-cKO-HFSCs größer war als bei β-cat-Ctrl-HFSCs (Abb. 7e), was darauf hindeutet, dass PKC bei β-cat-cKO-HFSCs eine Rolle stromabwärts von ROR2 spielt in der HFSC-Wartung. Zusammengenommen liefern unsere gemeinsamen Ergebnisse überzeugende Beweise dafür, dass die ROR2-abhängige Regulierung für die Proliferation und Aufrechterhaltung von HFSCs von entscheidender Bedeutung ist, insbesondere wenn HFSCs nicht in der Lage sind, sich richtig zu differenzieren.

Umfangreiche Untersuchungen darüber, wie Wnt-Signale das Verhalten von Stammzellen modulieren, haben sich auf den β-Catenin-abhängigen kanonischen Wnt-Signalweg konzentriert, es können jedoch nur sehr begrenzte Informationen über β-Catenin-unabhängige Signale in der Stammzellnische gefunden werden. Diese konzeptionelle Lücke hat uns dazu veranlasst, die funktionelle Bedeutung eines Wnt-Rezeptors ROR2 bei der Regulation von Stammzellen anhand des HF als Modellsystem zu untersuchen. Mithilfe eines genetischen Mausmodells haben wir gezeigt, dass ROR2 für die Selbsterneuerung und langfristige Aufrechterhaltung von HFSC unverzichtbar ist. Weitere Analysen mit kultivierten HFSCs zeigten, dass ROR2 nicht nur Wnt5a-aktivierte nicht-kanonische Wnt-Signale und -Migration durch die Aktivierung von PKC, JNK und kleinen GTPasen transduziert, sondern auch für die Wnt3a-induzierte Expression kanonischer Wnt-Zielgene in HFSCs über die Regulierung von GSK3β erforderlich ist Stabilität. Bemerkenswerterweise haben wir bei der Suche nach einer ROR2-abhängigen Regulierung, die für die HFSC-Aufrechterhaltung verantwortlich ist, eine bisher nicht erkannte Funktion von ROR2 bei der Regulierung der ATM/ATR-abhängigen DDR entdeckt, die für die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität von HFSC wichtig ist. Schließlich haben unsere Analysen mit β-Catenin-Null-HFSCs außerdem eine kompensatorische Rolle der ROR2-PKC-Signalübertragung beim Schutz von HFSCs, insbesondere für diejenigen, die nicht in der Lage sind, richtig zu differenzieren, vor dem unkontrollierbaren Verlust enthüllt. Insgesamt liefern unsere Ergebnisse einen Einblick in ein Signalnetzwerk, das von einem Wnt-Rezeptor im Kontext von Stammzellen kreuzreguliert wird (Abb. 7f).

Mehrere Studien haben die Annahme gestützt, dass ROR2 den Wnt5a-abhängigen Antagonismus der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung vermittelt22,30,31,32,33. Unsere Daten deuten jedoch darauf hin, dass ROR2 nicht nur für die Aktivierung der Wnt5a-abhängigen Signalübertragung verantwortlich ist, sondern auch für die kanonische Wnt-aktivierte Transkriptionsregulation in HFSCs essentiell ist. Wir haben gezeigt, dass kanonische Wnt-Zielgene in Ror2-depletierten HFSCs bei der durch Enthaarung induzierten HFSC-Aktivierung herunterreguliert wurden und dass diese Prozesse zu Beginn des Anagens überwiegend durch Wnt/β-Catenin-Signale gesteuert werden, um den Eintritt in den Haarzyklus zu fördern61,63. Wir fanden auch heraus, dass die Ror2-Depletion die Wnt3a-induzierte Transkriptionsaktivierung in kultivierten HFSCs aufgrund der freigesetzten GSK3β-Aktivität verringerte. Sowohl In-vivo- als auch In-vitro-Analysen deuten darauf hin, dass ROR2 die Wnt/β-Catenin-Signalübertragung in HFSCs über die Regulierung der GSK3β-Stabilität eher aktiviert als antagonisiert. Unsere Ergebnisse stimmen mit den Studien überein, die zeigen, dass überexprimiertes ROR2 die durch Wnt/β-Catenin-Signalisierungsreporter gemessene Wnt3a-induzierte β-Catenin-Signalaktivität verstärken kann31,35,36. Unser Forschungsmodell bietet jedoch einen physiologischen Kontext, der es uns ermöglicht, die Wirkung von endogenem ROR2 bei der Regulierung der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung zu bestimmen.

Es wurde gezeigt, dass sich HFSCs während des gesamten Haarzyklus in der Nische befinden, die reich an nicht-kanonischen Wnt-Liganden ist, z. B. Wnt4 und Wnt11,56,66,78, was die Möglichkeit impliziert, dass nicht-kanonische Wnt-Signale in HFSCs zur Aufrechterhaltung aktiviert werden. In unserer Studie zeigen wir, dass ROR2 für die Aktivierung nicht-kanonischer Wnt-induzierter Signale in HFSCs unerlässlich ist und dass eine Population von HFSCs ohne ROR2 nicht aufrechterhalten werden könnte. Darüber hinaus wird ROR2 in β-Cat-cKO-HFSCs, in denen die kanonische Wnt-Signalisierung unterdrückt wird, hochreguliert, um β-Catenin-Null-HFSCs vor dem Verlust zu schützen. Alle diese Ergebnisse stützen ein Modell, bei dem die ROR2-abhängige Regulierung, die zumindest teilweise durch nicht-kanonische Wnts aktiviert wird, eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Ruhezustands und/oder des aktivierten Zustands von HFSCs spielt. Durch die Untersuchung von Ror2-abgereicherten HFSCs in Kultur haben wir eine ROR2-abhängige Regulation in ATM/ATR-vermitteltem DDR identifiziert, die für die langfristige Aufrechterhaltung von HFSCs von entscheidender Bedeutung ist. Es bleibt jedoch unklar, ob dieser Mechanismus von HFSCs in ihrer Nische genutzt wird und ob die Regulierung von DDR durch ROR2 von Wnt abhängt. Zukünftige Untersuchungen sollten sich daher auf die Analyse der Wnt-Abhängigkeit bei der ROR2-vermittelten Regulation und die Entschlüsselung des ROR2-Mechanismus, der der oben genannten Regulation zugrunde liegt, konzentrieren, z. B. durch die Identifizierung von ROR2-interagierenden Proteinen.

Unsere Analysen mit dem In-vivo-Mausmodell zeigen, dass zwar eine Population von Ror2-abgereicherten HFSCs nach der ersten Runde der HF-Regeneration verloren ging, die wiederhergestellten Ror2-cKO-HFSCs nach dem Prozess jedoch in der Lage waren, die HF-Linie in der folgenden Regeneration aufrechtzuerhalten und wieder aufzufüllen. Allerdings konnten FACS-gereinigte Ror2-cKO-HFSCs in dem die Proliferation fördernden Medium nicht langfristig in Kultur gehalten werden. Diese Diskrepanz beim HFSC-Überleben in vivo und in Kultur ist wahrscheinlich auf die Unterschiede in der Häufigkeit der HFSC-Proliferation zurückzuführen. HFSCs, die sich in ihrer ursprünglichen Nische befinden, bleiben bis zum Beginn des Haarzyklus in einem Ruhezustand. Selbst zu Beginn der Anagenphase proliferiert nur eine Untergruppe der HFSCs zur Selbsterneuerung und Regeneration. Im Gegenteil, HFSCs in Kultur vermehren sich ständig, was HFSCs anfällig für DNA-Schäden macht. Angesichts des Mangels an Ror2-depletierten HFSCs in ATM/ATR-abhängigem DDR könnte eine hohe Häufigkeit der DNA-Replikation zu einer schnellen Anhäufung von DNA-Schäden führen, die anschließend zum Stillstand des Zellzyklus oder zum Tod führen. Dies erklärt, warum Ror2-cKO-HFSCs in Kultur stärkere Phänotypen aufwiesen als diejenigen, die in ihrer Nische vorkommen.

Unsere Identifizierung der Doppelrollen von ROR2, die an der kanonischen und nicht-kanonischen Wnt-Signalisierung beteiligt sind, kristallisierte die Idee heraus, dass Zellen verschiedene Wnt-Signalisierungskomponenten nutzen, um ein Wnt-Signalisierungsnetzwerk aufzubauen, um die Stabilität des zellulären Zustands aufrechtzuerhalten. Die Fähigkeit von ROR2, zustandsspezifische Signale zu übertragen, hängt wahrscheinlich von der Verfügbarkeit von Co-Rezeptoren, interagierenden Proteinen oder nachgeschalteten Effektoren ab. Daher kann die ROR2-abhängige Signalübertragung zelltypspezifische Effekte auslösen und zu einem situationsabhängigen funktionellen Ergebnis führen. Diese letzte Vermutung kann dem System die erforderliche Flexibilität verleihen, um mehrere Funktionen auszuführen. Zukünftige Studien sollten sich mit den Wechselwirkungen zwischen ROR2-abhängiger kanonischer und nicht-kanonischer Wnt-Signalisierung befassen, die zur Selbsterneuerung und Aufrechterhaltung von HFSCs beitragen.

Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der Tierethikkommission der Universität der Katholischen Universität von Louvain gehalten und behandelt. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den belgischen Tierschutzbestimmungen durchgeführt. Alle Labormäuse werden in 12:12 Licht-Dunkel-Lichtzyklen bei einer Umgebungstemperatur von 20–24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 45–65 % gehalten. K15CrePGR- und Ror2fl/fl-Mäuse auf einem C57BL/6J-Hintergrund wurden vom Jackson-Labor erhalten. Induzierbare Knockout-Mauslinien wurden durch Kreuzung von K15CrePGR79, Ror2fl/fl und/oder Ctnnb1fl/fl,80, ROSA26LSL-YFP,81 erzeugt. Die Strategie zur Erzeugung von Ror2-cKO und ihren Kontroll-Wurfgeschwistern bestand in der Züchtung von K15CrePGR+;Ror2+/fl;Rosa26LSL-YFP-Männchen mit Ror2fl/fl; Rosa26LSL-YFP-Weibchen. Die Kontrolltiere für Ror2-cKO-Mäuse waren geschlechtsgleiche heterozygote (Cre+) Ror2-Wurfgeschwister oder nur dann Wildtyp-Wurfgeschwister (Cre-), wenn die Wurfgeschwister von Ror2-cKO-Mäusen keine heterozygoten Ror2-Mäuse enthielten. Die Cre-Rekombinase-Aktivität wurde durch intraperitoneale Injektion von RU486 (1 mg/Maus; TCI Europe NV) an P18, P21 und P24 und tägliche topische Verabreichung von 4 % RU486 in Ethanol von P21–P25 induziert. Um eine synchronisierte HFSC-Aktivierung zu induzieren, wurde bei P55 eine HF-Enthaarung an anästhesierten Mäusen durchgeführt. Zur PKC-Inhibitor-Behandlung wurden 3 Tage lang jeden zweiten Tag 100 μg GF109203X (R&D Systems) in Aceton (1 μg/μl) oder Aceton allein auf die Rückenhaut von P55-Mäusen aufgetragen. Die Experimente wurden auf der Grundlage von geschlechts-, alters- und stammesgleichen Paaren, hauptsächlich Wurfgeschwistern, konzipiert und an ≥3 Paaren von Probensätzen wiederholt. Der Phänotyp und die erhaltenen Ergebnisse waren sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Paaren reproduzierbar.

Die FACS-Reinigungsverfahren waren wie zuvor beschrieben63,78. Kurz gesagt, die Rückenhaut wurde geerntet, zur Fettentfernung abgetrennt und in 0,25 % Trypsin für 30 Minuten (Frauen) bzw. 40 Minuten (Männer) bei 37 °C inkubiert. Epidermis- und HF-Zellen wurden abgekratzt und die Zellsuspension durch 70- und 40-μm-Zellsiebe (Fischer Scientific) filtriert. Die gesammelten Zellen wurden in PBS mit 4 % FBS suspendiert und vor der FACS mit Antikörpern inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden dann mit einem FACS Aria III (BD Biosciences) mit der Software FACS Diva v8.0.1 sortiert. Um abgestorbene Zellen auszuschließen, wurde der fixierbare Lebensfähigkeitsfarbstoff eFluor 780 verwendet. Lebende HFSCs wurden dann basierend auf der Oberflächenexpression von Integrin α6, CD34 und zytosolischem YFP sortiert. Das FACS-Gating-Schema ist in der ergänzenden Abbildung 11 dargestellt. Die Zellen wurden entweder in TRI-Reagenz (Sigma-Aldrich) zur RNA-Reinigung, vorbeschichteten 15-ml-Flacon-Röhrchen zur Proteinreinigung oder Kulturmedium mit Feeder-Zellen zur Koloniebildung gesammelt.

Hautbiopsien wurden gesammelt und 4 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert und dann über Nacht in 30 % Saccharose bei 4 °C eingetaucht, bevor sie in die OCT-Verbindung eingebettet wurden. Bei Vollhautpräparaten wurde Fett von der Rückenhaut entfernt und dann in 2 mg/ml Dispase (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 20 mM EDTA, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Hautepidermis mit den daran befestigten Haarfollikeln von der Dermis abgezogen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in 4 % PFA fixiert. Gewaschene ganze Reittierhäute wurden zur weiteren Verwendung in PBS bei 4 °C gelagert.

Für die Immunfluoreszenz wurden 7 µm-Gewebeschnitte fixiert, gewaschen und 20 Minuten lang in 0,5 % Triton-X100 permeabilisiert. Die Schnitte wurden dann in Immunfluoreszenz-Blockierungspuffer (0,3 % Triton Antikörper bei 4 °C über Nacht. Gegebenenfalls wurde das MOM Fluorescein Kit (Vector Laboratories) verwendet, um die unspezifische Bindung primärer monoklonaler Mausantikörper zu verhindern. Gewebeschnitte wurden gewaschen und mit Alexa Fluor-konjugiertem Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch) 1 Stunde lang bei RT inkubiert, bevor sie mit DAPI (Roth) enthaltendem Eindeckmedium montiert wurden. Für Whole-Mount-Gewebe wurde die Immunfärbung wie zuvor beschrieben durchgeführt, wobei die Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert wurden63. Bilder der Immunfluoreszenzfärbung wurden mit der Zen-Software v3.0 (Zeiss) auf einem Axio Vert.A1-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) oder der Zen-Software v2.6 (Zeiss) auf einem konfokalen Axio Observer Z1-Mikroskop (Zeiss) aufgenommen. Die Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ gemessen.

Um die HFSC-Proliferation in vivo nachzuweisen, wurde 1 mg EdU (5-Ethinyl-2′-desoxyuridin; TCI Europe) pro Maus 24 Stunden lang zweimal im Abstand von 12 Stunden intraperitoneal injiziert, bevor Hautproben entnommen wurden. Für den EdU-Markierungstest in vitro wurden HFSCs auf Nunc Lab-Tek II-Kammerobjektträgern (Thermo Fisher Scientific) gezüchtet, die mit 10 μg/ml Fibronektin (Merck Millipore) beschichtet waren. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit DMSO (Vehikel), 2 μM SP600125 (JNKi) oder 0,5 μM GF109203X (PKCi) inkubiert und dann vor dem Nachweis 4 Stunden lang mit 10 μM EdU markiert. Eingebautes EdU wurde mit einem Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers erkannt.

Für Koloniebildungstests wurden FACS-gereinigte HFSCs mit 20.000 Zellen/Well (für HFs mit Anagenbeginn) oder 33.000 Zellen/Well (für HFs in der Telogenphase) einer Sechs-Well-Platte mit Mitomycin C-behandelten J2 3T3-Mausfibroblasten-Feedern ausgesät ( freundliches Geschenk des E. Fuchs-Labors mit Zustimmung des H. Green-Labors). Nach zweiwöchiger Kokultur wurden die Kolonien dann mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 1 % Rhodamin B gefärbt. Für die Analyse wurde die Anzahl der Kolonien mit einer Größe ≥ 3 mm2 gezählt. Für Langzeitpassagierungsexperimente wurden drei unabhängige Gruppen von jeweils 6 Kolonien mit Klonzylindern (Bel-Art) ausgewählt und auf mit Mitomycin C behandelten Fibroblasten-Feedern in 24-Well-Platten passagiert. HFSCs wurden trypsiniert und alle 10 Tage für 10 Passagen in einer Verdünnung von 1:10 auf Feeder passagiert. Die Expression von Ror2 aus jeder einzelnen Kolonie wurde durch RT-qPCR validiert.

FACS-gereinigte HFSCs aus der Rückenhaut von Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP-Mäusen wurden wie beschrieben auf Mitomycin C-behandelten Fibroblasten-Feedern in Medium mit 0,3 mM Calcium kultiviert und expandiert82. Nach 10 Passagen wurden die HFSCs aus den Futterspendern entnommen und waren für eine lentivirale Infektion bereit. Zur Behandlung von Wnts wurden HFSCs 16 Stunden lang mit Medium, das 0,5 % FBS enthielt, ausgehungert und dann mit Vehikel (PBS), trägerfreiem 100 ng/ml Wnt3a (R&D Systems) oder 300 ng/ml Wnt5a (R&D Systems) behandelt. 30 oder 60 Minuten vor der Ernte zur Proteinreinigung oder 6 Stunden zur mRNA-Reinigung. Zur Behandlung von GSK3- oder PKC-Inhibitoren wurden HFSCs vor der Ernte zur Proteinextraktion 24 Stunden lang mit Vehikel (DMSO) oder 1 µM CHIR99021 (R&D Systems) oder 1 µM GF109203X (R&D Systems) behandelt.

Für den gerichteten Zellmigrationstest wurde der kolorimetrische QCM 24-Well-Zellmigrationstest (Merck) gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Um die Fähigkeit zur kollektiven Zellmigration zu analysieren, wurde ein Kratzwunden-Migrationstest durchgeführt. Kurz gesagt, Feeder-freie HFSCs wurden kultiviert, um zu einer konfluenten Monoschicht zu wachsen, und dann wurde die HFSC-Monoschicht in dem Medium, das 1 % FBS mit oder ohne 8 µg/ml Mitomycin C (Merck) enthielt, mit einer Pipettenspitze in einer geraden Linie abgekratzt eine Lücke schaffen. Bilder des Lückenschlusses wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop 0, 8 und 24 Stunden nach dem Kratzen aufgenommen und die Lücken zu jedem Zeitpunkt mit ImageJ gemessen. Die dargestellten Daten sind die Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten.

Zur Zellzyklusanalyse wurde die DNA von HFSCs 1 Stunde lang mit 10 µg/ml DAPI bei 37 °C gefärbt und der DNA-Gehalt mit dem LSR Fortessa-Durchflusszytometer mit der Software FACS Diva v8.0.1 (BD Biosciences) gemessen und mit FlowJo analysiert v10.7.2-Software. Um den Gehalt an intrazellulären ROS zu messen, wurden HFSCs mit CellROX Deep Red-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) angefärbt und mit einem LSR Fortessa-Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

HEK293FT-Zellen (Thermo Fisher Scientific) wurden mit einer Plasmidmischung, die das lentivirale exprimierende Plasmid pLKO.1 sowie die viralen Verpackungsplasmide PAX2 und MD2 enthielt, CaCl2-transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurde virushaltiger Überstand von transfizierten HEK293FT-Zellen gesammelt, gefiltert und mit Polybrene (Sigma-Aldrich) und weiteren 10 % FBS gemischt, bevor er auf Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP-HFSCs aufgetragen wurde. Die Virusinfektion wurde durch Zentrifugation von HFSCs mit einer virushaltigen Mischung bei 1100 × g und 35 ° C für 1 Stunde durchgeführt. 5 Tage nach der Infektion wurden HFSCs durch FACS auf Basis der RFP- und/oder YFP-Expression gereinigt. Die folgenden lentiviralen exprimierenden Plasmide wurden verwendet: pLKO.1-NLS-iCre-mRFP (freundliches Geschenk von S. Beronja)83, pLKO.1-MCS-mRFP (abgeleitet von pLKO.1-NLS-iCre-mRFP, wobei NLS-iCre wurde durch mehrere Klonstellen ersetzt).

Gesamt-RNAs aus FACS-sortierten Zellen oder kultivierten Zellen wurden mit dem Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research) gereinigt und mit dem ProtoScript(r) II First Strand cDNA Synthesis Kit (New England Biolabs) revers transkribiert. cDNAs wurden mit den angegebenen Primern im quantitativen PCR-Assay SYBR Green (Bio-Rad) auf dem Echtzeit-PCR-System Thermoblock 96 Silver Block (Bio-Rad) amplifiziert und die Zykluszahlen wurden mit der Software CFX Manager v3.1 aufgezeichnet. Die relativen Expressionsniveaus wurden auf die PCR-Amplifikation des Housekeeping-Gens Ppib2 oder Rps16 normalisiert. Die für die mRNA-Expression verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Fehlerbalken für qPCR-Analysen wurden aus den unabhängigen biologischen Replikaten (n ≥ 3) berechnet, die in jedem Datensatz angegeben sind.

HFSCs wurden ausgehungert und dann 2 Stunden lang mit 300 ng/ml Wnt5a behandelt, bevor sie für den kleinen GTPase-Aktivierungstest geerntet wurden. Für den kleinen GTPase-Aktivierungstest wurde das Rac1/Cdc42-Aktivierungstest-Kombinationskit (Cell Biolabs) gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Für die Immunoblot-Analyse wurden Proteine ​​aus Zellen mit RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % NaDeoxycholat, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA, Proteaseinhibitor, Phosphataseinhibitoren) extrahiert. . Proteinlysate wurden dann in ein 4–12 %iges Bis-Tris-Gel (Thermo Fisher Scientific) geladen und auf eine Nitrozellulosemembran (Thermo Fisher Scientific) übertragen. Übertragene Membranen wurden 1 Stunde lang bei RT mit 5 % BSA in TBST-Puffer blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Blots gewaschen und dann 1 Stunde lang mit den HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (Jackson ImmunoResearch) inkubiert. Die Blots wurden unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Nachweisreagenzes (SuperSignal West-Substrate, Thermo Fisher Scientific) entwickelt und die Signale wurden dann mit dem Fusion SL-Bildgebungssystem (Vilber) mit der Software Fusion-Capt Advance Solo 4S v16.16b erfasst.

Die folgenden Antikörper (Abs) wurden für FACS verwendet: Lebensfähigkeitsfarbstoff F780 (1:200, 65-0865), Integrin α6 (1:500, PE-konjugiert, Klon GoH3, 12-0495) und CD34 (1:100, Alexa Fluor 660-konjugiert, Klon RAM34, 50-0341) von eBiosciences. Die folgenden Abs wurden für das Immunblotting verwendet: ROR2 (Ror2) von Developmental Studies Hybridoma Bank; ROR1 (Klon D6T8C, 16540), p-JNKT183/Y185 (Klon 81E11, 4668), JNK (Klon 56G8, 9258), p-PKCS660 (9371), PKCα (2056), Dvl2 (Klon 30D2, 3224), p- LRP6S1490 (2568), LRP6 (Klon C5C7, 2560), p-GSK3βS9 (9336), GSK3β (Klon 27C10, 9315), p-β-CateninS33/37/T41 (9561), Axin1 (Klon C76H11, 2087), CK1 (2655), p-ATMS1981 (Klon D6H9, 5883), ATM (Klon D2E2, 2873), p-ATRS428 (2853), ATR (2790), p-CHK2T68 (2661), CHK2 (2662), p-CHK1S345 ( Klon 133D3, 2348), CHK1 (Klon 2G1D5, 2360), p-AMPKT172 (Klon 40H9, 2535), AMPKα (2532), α-Tubulin (2144), Lamin B1 (Klon D9V6H, 13435), Vinculin (Klon E1E9V, 13901) und p-ATM/ATR-Substrate (2851) von Cell Signaling Technology; p-NRF2S40 (Klon EP1809Y, ab76026) und NRF2 (ab137550) von Abcam; β-Catenin (Klon 15B8, C7207) und β-Aktin (Klon AC-74, A2228) von Sigma-Aldrich; CD34 (Klon RAM34, 13-0341) von eBiosciences; Rac1 (Klon 23A8, 05-389), Cdc42 (07-1466) und GAPDH (Klon 6C5, MAB374) von Merck-Millipore; Krt5 (905901) und Krt15 (833901) von Biolegend; p-GSK3βY216 (Klon 13A, 612313) von BD Biosciences; HRP-konjugierte Sekundärantikörper (715-035-150, 711-035-152, 712-035-150) von Jackson ImmunoResearch. Alle für das Immunblotting verwendeten Primärantikörper hatten eine Verdünnung von 1:1000 und Sekundärantikörper eine Verdünnung von 1:4000. Die folgenden Abs wurden für die Immunfärbung verwendet: ROR2 (1:100, Ror2) von Developmental Studies Hybridoma Bank; ROR1 (1:100, 16540), p-JNKT183/Y185 (1:100, 4668), JNK (1:100, 9258), p-PKCS660 (1:100, 9371), PKCα (1:100, 2056) , γH2AX (1:200, BET A300-081A-M) von Cell Signaling Technology; GFP (1:1000, ab13970) von Abcam; β-Catenin (1:100, C7207) von Sigma-Aldrich; CD34 (1:100, 13-0341) von eBiosciences; 8-oxoG (1:100, Klon 483.15, MAB3560) von Merck-Millipore. Fluoreszierende Farbstoff-konjugierte Sekundärantikörper (703-545-155, 715-545-150, 715-585-150, 711-545-152, 711-585-152, 712-545-150, 712-585-150) von Jackson ImmunoResearch.

Tierversuche wurden an gleichen Zahlen männlicher und weiblicher Mäuse durchgeführt. Die Phänotypen sind repräsentativ für mindestens drei geschlechtsgepaarte Wurfgeschwister (n ≥ 3). Die Experimente wurden nicht randomisiert und die Forscher wurden während der Datenerfassung nicht verblindet. Alle RT-qPCR-Ergebnisse werden aus mindestens drei biologisch unabhängigen Tieren oder unabhängigen Experimenten generiert. Alle Ergebnisse der histologischen Analyse, des Immunblottings und der Immunfluoreszenzfärbung sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Die Diagramme wurden mit GraphPad Prism 8 dargestellt. Box-Whisker-Diagramme werden als Median (die Linie innerhalb der Box), als 25. bis 75. Perzentil (untere und obere Linie der Box) und als 10. bis 90. Perzentil (untere und obere Whisker) dargestellt ). Punktdiagramme wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Andere Daten wurden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben; * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005 oder angegebene p-Werte in Abbildungslegenden. Statistische Analysen wurden für alle Experimente mit dem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle diese Studie unterstützenden Daten sind in der Quelldatendatei enthalten, die diesem Dokument beiliegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Nicolas Dauguet für die FACS-Sortierung (FACS-Einrichtung am De Duve Institute); Slobodan Beronja, Valeri Vasioukhin, Frederic Lemaigre und Christophe Pierreux für Diskussionen und Kommentare. AV und CMRL werden durch FRIA-Stipendien (1.E136.15 an AV und 1.E041.16 an CMRL) des Fonds de la Recherche Scientifique (FNRS) und Patrimoine-Stipendien der Université catholique de Louvain (UCLouvain) unterstützt. GC ist FSR-Stipendiat von UCLouvain und Aspirant-Stipendiat (1.A551.19) von FNRS. CKC wird von der Fondation Contre le Cancer und dem FSR-Postdoc-Stipendium der UCLouvain unterstützt. W.-HL ist ein unabhängiger Ermittler des FNRS. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse (an W.-HL) von FNRS (Ulysse-F.6002.14 und PDR-T.0078.16), Fonds Joseph Maisin (2016-2018) und Fondation Contre le Cancer (FAF-F/2016/) unterstützt. 792).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Anthony Veltri, Christopher MR Lang.

de Duve-Institut, Katholische Universität Löwen, 1200, Brüssel, Belgien

Anthony Veltri, Christopher MR Lang, Gaia Cangiotti, Chim Kei Chan und Wen-Hui Lien

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AV und W.-HL konzipierten die Studien- und Designexperimente. AV führte den Großteil der Experimente durch, analysierte Daten und erstellte Zahlen. CL entwickelte Assays für lentivirale Infektionen und führte während der Überarbeitung kritische Experimente durch; GC führte einen Teil der histologischen Analysen, Zellkultur- und RT-qPCR-Experimente durch; CKC führte einen Teil der FACS-Experimente, Immunblotting, Zellzyklusanalyse und ROS-Messung durch; W.-HL betreute die Studie, führte einige Zellkulturexperimente durch, analysierte Daten, erstellte Zahlen und verfasste die Arbeit. Alle Autoren lieferten intellektuelle Beiträge und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Wen-Hui Lien.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Mingxing Lei, Daniela Ungureanu und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Veltri, A., Lang, CMR, Cangiotti, G. et al. ROR2 reguliert die Selbsterneuerung und den Erhalt der Stammzellen der Haarfollikel. Nat Commun 13, 4449 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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Eingegangen: 26. Juni 2019

Angenommen: 21. Juli 2022

Veröffentlicht: 01. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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